怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因克隆、亚细胞定位和组织表达分析

洪森荣，向琼钰，谢 颖，熊晨露，徐晨慧，徐璐珂，陈荣华，蔡 红

(1.上饶师范学院 生命科学学院，江西 上饶334001； 2.上饶市药食同源植物资源保护与利用重点实验室，江西 上饶 334001； 3.上饶市三叶青保育与利用技术创新中心，江西 上饶 334001； 4.上饶农业技术创新研究院，江西 上饶 334001； 5.上饶市红日农业开发有限公司，江西 上饶334700)

三叶青(Diels et Gilg)，为我国特有珍稀濒危药用植物。三叶青可理气健脾，增强免疫，具抗癌、抗炎、解热镇痛、保肝消肿等作用。病毒增殖涉及多种宿主因子与病毒基因组编码因子协同作用。而最近的基因和生化分析已经揭示病毒增殖的一些重要宿主因子，然而关于这些宿主因子认识仍然有限。为了确定烟草病毒高效增殖所必需的宿主因子，有研究分离了拟南芥的两个独立突变体，命名为烟草病毒增殖蛋白1(tobamovirus multiplication 1，TOM1)和烟草病毒增殖蛋白2(tobamovirus multiplication 2，TOM2)。两个独立突变体TOM1和TOM2的烟草病毒增殖降低到低水平，致病突变对烟草病毒的细胞内增殖是隐性且有特殊影响，但对黄瓜花叶病毒或芜菁皱褶病毒(TCV)的细胞内增殖没有影响。因此，克隆三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因并进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析，对研究烟草病毒增殖蛋白1基因在三叶青中的表达和三叶青烟草花叶病毒的增殖具有重要意义。关于烟草病毒增殖蛋白1研究的报道较少。研究表明，烟草病毒增殖蛋白1(tobamovirus multiplication 1，TOM1)基因被鉴定并发现其编码一种推测的七通道跨膜蛋白。TOM1蛋白与烟草病毒螺旋酶结构域多肽的相互作用以及TOM1及其同源物TOM3同时失活可完全抑制烟草病毒增殖业已被证实。拟南芥TOM1和TOM3基因可编码烟草病毒增殖所需的同源蛋白。尽管拟南芥基因组编码另一个TOM1样基因THH1支持烟草病毒增殖，但作用低于TOM1和TOM3。目前，对三叶青的研究主要集中在化学成分、药理临床、种植栽培、组织培养等方面，关于三叶青烟草病毒增殖蛋白1方面的研究尚未见报道。本文拟利用RT-PCR 技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因，并采用生物信息学方法、烟草叶片瞬时表达和实时荧光定量 PCR进行序列分析、亚细胞定位分析和组织表达分析，为揭示怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1的生物学功能提供理论依据，为从分子水平调控怀玉山三叶青烟草病毒增殖提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

怀玉山三叶青2个栽培种怀玉1号和怀玉2号试管苗。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取和cDNA第一链的合成

用Trizol试剂提取怀玉山三叶青怀玉2号试管苗的总 RNA，提取步骤按说明书进行，使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的浓度和完整性。以提取获得的 RNA为模板，按照 M-MLV cDNA 第一链合成试剂盒说明书合成 cDNA 第一链。逆转录引物用 Oligo(dT) 18 Primer ：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具体步骤按说明书进行。

1.2.2 烟草病毒增殖蛋白1(tobamovirus multiplication protein 1，TP1)基因的克隆

利用转录组组装的Unigene序列信息(TRINITY_DN20910_c0_g1)，运用 Primer Premier 5.0 设计引物(F：5′-ATGAGGGAGCTGGTCTCCTCC-3′；R：5′-CTAGTTAATAGGGTGATATTGCGCC-3′)。PCR扩增条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，58.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有目的基因的条带与 pMD19-T 载体连接并用热激法转化到感受态细胞大肠埃希菌()DH5α，经鉴定正确的阳性转化子提取质粒送往上海生工进行测序。

1.2.3 烟草病毒增殖蛋白1基因的生物信息学分析

使用 BioEdit软件翻译基因序列为氨基酸序列，用 ProtParam预测酶的理化性质，用 ProtScale预测酶的疏/亲水性。使用GOR I软件在线预测酶的二级结构。使用SWISS-MOLD在线预测酶的三级结构。采用 WoLFPsort在线预测基因的表达部位。通过软件DNAMAN和 Bioedit进行氨基酸序列比对，利用MEGA5.0软件进行系统进化树的构建。

1.2.4 基因克隆和载体构建

以提供的目的基因序列设计引物(去掉终止密码子TAG/TAA/TGA)，CZ-TP1-HⅠ-101F: 5′-TCGACCCCGGGGGTACC(载体同源重组序列)ATGAGGGAAAGGCCTGTGGG-3′；CZ-TP1-HⅠ-101R: 5′-GCCCTTGCTCACCAT(载体同源重组序列)ACGGATGGGATGATACTG-3′，以第一次构建载体为模板，以所述引物进行PCR扩增(采用Vazyme公司phanta max super-fidelity DNA Polymerase)。PCR反应体系(总体积50 μL)包括17 μL ddHO、25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP Mix(10 mmol·L)、2 μL模板DNA、2 μL引物1(10 μmol·L)、2 μL引物2(10 μmol·L)和Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease(1 U·μL)；PCR反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，退火温度50 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 1 min，39个循环；最后延伸72 ℃ 5 min。将PCR产物进行凝胶电泳。将条带切胶回收，即为目的基因片段。用HⅠ酶切载体pRI101-GFP线性化，回收后和目的基因片段重组反应(采用Thermo公司或TaKaRa公司相应限制性内切酶产品)。酶切反应体系包括4 μL 10×K Buffer、5 μL 载体质粒、2 μLHⅠ和ddHO(补足至40 μL)。酶切产物纯化后与上述PCR产物进行重组反应(重组反应试剂盒为Vazyme公司ClonExpress-Ⅱ One Step Cloning Kit)。重组连接反应体系(总体积10 μL)包括4 μL 线性化载体、1 μL 插入片段、2 μL 5×CE Ⅱ Buffer、1 μL Exnase Ⅱ和ddHO(补足至10 μL)。上述反应液使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底。放置于37 ℃反应30 min，随后立即置于冰上冷却。重组产物转化大肠埃希菌DH5α细胞。挑取PCR阳性的转化子摇菌培养提取质粒，同时扩增产物送测序。扩增和测序引物为插入目的基因两侧的载体序列(目的基因较短则只进行一侧测序)，分别为35S-F：5′-GACGCACAATCCCACTATCC-3′；GFP-JR：5′-GGGTGAGCTTGCCGTAGGTG-3′。

1.2.5 烟草叶片亚细胞定位

播种烟草，培养约一个月用于实验；将构建好的载体质粒转入农杆菌GV3101，涂布卡那霉素抗性平板，挑取单克隆于YEB液体培养基在28 ℃摇床内培养2 d，菌体4 000 r·min离心4 min，去上清后菌体用10 mmol·LMgCl(含120 μmol·LAS)悬浮液重悬菌体，调整至0.6左右；用无针头的1 mL注射器吸取农杆菌液，从烟草叶片下表皮(背面)压迫注射；将注射完成的烟草植株弱光培养2 d，即可观察；接种2 d后取注射区域的烟草叶片，制作玻片，在激光共聚焦显微镜(FLUOVIEW FV1Oi，OLYMPUS公司)下观察、拍照；同时以空载体转化的农杆菌作为对照重复上述操作。叶绿体荧光信号说明：叶绿体荧光信号激发波长640 nm，发射波长675 nm；GFP信号说明：绿色荧光蛋白GFP：激发光488 nm，发射光510 nm。

1.2.6 烟草病毒增殖蛋白1基因的组织表达分析

分别取怀玉山三叶青2个栽培种怀玉1号和怀玉2号试管苗的根、茎、叶RNA 500 ng，反转录为cDNA。实时荧光定量 PCR(qRT-PCR，SYBR Green Ⅰ)检测内参基因为。设计引物(F：5′-ACAAGTAAGGTGTAGGCCGAGAA-3′；R：5′-CCACGCAGAAGGTGTTCCA-3′；大小163 bp，退火温度53.1 ℃)。qRT-PCR 检测采用 20 μL反应体系，PCR反应程序：预变性95 ℃ 10 min；变性95 ℃ 10 s，退火延伸60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，40个循环。使用 2-△△C法计算基因表达水平。实验重复3次。所有数据表示为平均值±标准差，并使用SPSS19.0软件进行统计分析，应用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验烟草病毒增殖蛋白1基因组织表达的差异显著性(<0.05)。

2 结果与分析

2.1 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因cDNA序列

通过对怀玉山三叶青怀玉1号(HY1组)和怀玉2号(HY2组)块根(同一大棚同一栽培基质同一栽培时间)的转录组分析，再通过差异表达基因分析确定烟草病毒增殖蛋白1基因的核心片段，发现转录组数据库中只有1条1同源基因的序列信息。通过PCR扩增技术(图1)，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因cDNA总长度为888 bp(图2)，G+C 含量为51.58%(图3)。

图1 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因PCR扩增

图2 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因碱基组成

图3 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因各碱基的比例

2.2 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1氨基酸序列

Protparam预测显示，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1氨基酸序列见图4。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1由295个氨基酸组成，分子量33 173.36 u，等电点9.16，为疏水性蛋白。各氨基酸的数目和比例为Ala(A)(29，9.8%)、Arg(R)(15，5.1%)、Asn(N)(7，2.4%)、Asp(D)(8，2.7%)、Cys(C)(5，1.7%)、Gln(Q)(8，2.7%)、Glu(E)(11，3.7%)、Gly(G)(13，4.4%)、His(H)(6，2.0%)、Ile(I)(21，7.1%)、Leu(L)(41，13.9%)、Lys(K)(11，3.7%)、Met(M)(3，1.0%)、Phe(F)(20，6.8%)、Pro(P)(11，3.7%)、Ser(S)(19，6.4%)、Thr(T)(12，4.1%)、Trp(W)(6，2.0%)、Tyr(Y)(13，4.4%)、Val(V)(36，12.2%)。带负电荷残基总数(Asp+Glu)为19，正电荷残基总数(Arg+Lys)为26。序列的N端为M(Met)，序列的C端为N(Asn)。估计半衰期为：30 h(哺乳动物网织红细胞，体外)>20 h(酵母，体内)>10 h(大肠埃希菌，体内)。不稳定指数：失稳指数(II)计算为37.40，这将蛋白质分类为稳定的。

图4 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1氨基酸序列

2.3 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1亲疏水性分析

从图5可知，高峰值(正值)的区域表示疏水的区域，而负值的“低谷”区域是亲水区域。疏水性结果分析表明，最大疏水值为3.0左右，在该多肽中说明该处的疏水性最强；亲水峰最大值为-2.5左右，整个蛋白质表现出高度的疏水性，说明该蛋白为疏水性蛋白质。

图5 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1亲疏水值分布

2.4 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1二级结构分析

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1的二级结构(图6)预测如下：GOR 预测显示其二级结构由α-螺旋 Alpha helix(Hh，43.73%)、β-片层 Extended strand(Ee，21.69%)、 无规则卷曲 Random coil(Cc，34.58%)构成(图7)。从分布位点上来看，C端和N端含无规则卷曲、β-片层和α-螺旋，且无规则卷曲、β-片层和α-螺旋则散布于整个蛋白质中。

图6 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1二级结构

蓝色代表 α-螺旋；红色代表β-片层；紫色代表不规则卷曲。

2.5 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1三级结构分析

SWISS-MODEL预测显示，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1的三级结构为单体(图8)。

图8 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1三级结构

2.6 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1亚细胞定位预测

采用 WoLFPsort在线软件对怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因的表达部位进行预测(图9)，结果为：定位于内质网中的数量为5.5，内质网-质膜中的数量为4，细胞外的数量为3，细胞质中的数量为2，线粒体中的数量为2，质膜中的数量为1.5。表明怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因主要存在于内质网、内质网-质膜、细胞外、细胞质、线粒体和质膜中。

E.R.，内质网；E.R._plas，内质网-质膜；extr，细胞外；cyto，细胞质；mito，线粒体；plas，质膜。

2.7 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1系统进化分析

从构建的进化树(图10)中可见，怀玉山三叶青与subsp.(节节麦)、subsp.(硬粒小麦)、(大麦)在一个大分支下，这说明怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1在进化上与subsp.(节节麦)、subsp.(硬粒小麦)、(大麦)的亲缘关系较近，尤其是与subsp(节节麦)烟草病毒增殖蛋白1在进化上具有最高的亲缘关系。

图10 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1系统进化分析

2.8 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1同源蛋白的序列比对信息

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1同源蛋白的序列比对信息见图11。图11中※号区域是该蛋白家族的保守结构域。

图11 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因氨基酸序列的同源性比较

2.9 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因目的片段扩增与瞬时表达载体构建

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因目的片段扩增见图12。用HⅠ酶切载体pRI101-GFP线性化，回收后和目的基因片段重组反应。重组产物转化大肠埃希菌DH5α细胞。挑取PCR阳性的转化子摇菌培养提取质粒，对重组质粒进行酶切检测(图13)，同时扩增产物送测序。测序比对结果显示：目的基因已插入载体，表达载体构建准确。

图12 烟草病毒增殖蛋白1基因克隆电泳图(左)和菌落PCR电泳图(右)

第一行是参考序列，第二至三行是构建的GFP载体6号克隆用两端测序引物的测序结果。

2.10 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1亚细胞定位分析

从图14可知，利用激光共聚焦显微镜观察，融合GFP的烟草病毒增殖蛋白1转化烟草叶片只在细胞质(可能包括细胞膜)和细胞核膜观察到绿色荧光，表明烟草病毒增殖蛋白1定位于细胞质(可能包括细胞膜)和细胞核膜。

图14 TP1-GFP基因(上)和GFP对照(下)亚细胞定位照片

2.11 怀玉山三叶青2个栽培种不同器官中烟草病毒增殖蛋白1基因的表达分析

以怀玉山三叶青的为内参，利用实时荧光定量PCR分析怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因在怀玉山三叶青2个栽培种不同器官中的表达情况，结果显示，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因在根、茎、叶中均有表达，但在不同组织器官的表达情况差异显著(图15)，其中怀玉2号在叶中表达量最高，怀玉1号在茎中表达量最高。

同一品种柱上无相同字母的表示差异显著(P<0.05)。

3 讨论

宿主编码因子在病毒增殖中起着重要作用，与病毒编码因子协同作用。然而，关于这个过程中所涉及的宿主因素的信息是有限的。有研究报道TOM1 mRNA(876 nt)序列由11个外显子组成，编码一个291 aa多肽，该多肽被认为是一种多通道跨膜蛋白。Sos恢复系统(Sos recruitment system，SRS)实验支持TOM1与细胞膜相关的假设，且TOM1与tobamovirus(烟草病毒)编码的复制蛋白的螺旋酶结构域相互作用，TOM1可能作为膜锚参与体内复制复合物的形成。碱基组成和G+C含量基本平衡来看，G+C含量大于 50%，G+C的含量越高，基因稳定性越高，三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因1基本处于稳定状态，这可能为三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因1稳定遗传与进化提供了保证。从同源性来看，三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因1与节节麦、硬粒小麦和大麦同源性较高，说明三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因1具有保守性。这些保守区段的发现将为其他物种新的三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因1的克隆提供序列依据。

也有研究表明，拟南芥1基因编码一种多倍体跨膜蛋白，是烟草病毒高效增殖所必需的，对1基因具有严重破坏性的突变会使tobamovirus(烟草病毒)的增殖降低到较低水平，但不会完全破坏它。在本实验中，通过烟草叶片亚细胞定位分析表明，烟草病毒增殖蛋白1(TOM1)定位于细胞质(可能包括细胞膜)和细胞核膜中。

在本实验中，实时荧光定量PCR结果显示，烟草病毒增殖蛋白1基因1在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性，怀玉2号在叶中表达量最高，怀玉1号在茎中表达量最高。表明，怀玉2号叶和怀玉1号茎中烟草病毒增殖较快。本研究首次从怀玉山三叶青基因组中克隆出烟草病毒增殖蛋白1基因1的基因，并对克隆的基因序列和其氨基酸序列进行了生物信息学、亚细胞定位和组织表达分析，为三叶青烟草病毒增殖的研究补充了数据和资料。