不同铵硝比对烟株碳氮代谢酶活性及总糖、总氮含量的影响

谭玉娇，郭翠莲，王 可，杨林圜，汪晚晴，辉启林，毕鑫磊，赵正雄*

（1.云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 资源与环境学院，云南 昆明 650201；3.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201）

碳氮代谢是烟株最基础的生理代谢，也是决定烟叶产质量形成的重要代谢［1-3］。大量研究证实，优质烟叶形成的生理代谢要求呈现出前期氮代谢、碳的转化、固定代谢强、碳的积累代谢弱，而后期则表现出相反的趋势［4-5］。烤烟碳氮代谢进程的强弱及快慢受到诸多因素的影响，其中，品种是决定烤烟碳氮代谢的内在遗传因素［1，4］，除此之外，还有生物胁迫［6］、非生物胁迫［7-8］、激素［9-10］、打顶时期［11］、土壤pH值［12］，以及施入肥料的营养水平及营养类型，如氮水平［13-15］、氮素形态［16-19］。

硝酸还原酶（NR）是氮代谢过程中的重要守门酶；谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）是构成氮代谢过程GS/GOGAT偶联循环的关键成员酶，其中，谷氨酰胺合成酶因时空及组织的特异性而存在GS1和GS2两种同工酶；总氮是各时期氮代谢产生含氮化合物的重要集合体，它们在各时期的浓度及含量都对生育期内氮代谢的调控发挥着不可替代的作用［20-21］。蔗糖合成酶（SS）、磷酸蔗糖合成酶（SPS）、可溶性酸性转化酶（SAI）和α-淀粉酶是表征碳代谢强弱及其走向的关键酶，其中，SS和SAI酶是负责蔗糖水解的重要酶类，但其水解产物及时期不同，SAI酶主要在生育前、中期发挥提供碳骨架和能量的作用，维持碳的转化代谢；SS主要在生育后期发挥提供核苷酸类物质的作用，保证碳的积累代谢；SPS不可逆地催化蔗糖的合成，加持碳骨架的长距离运输工作；α-淀粉酶协调各时期叶绿体的库存工作，奠定碳的积累代谢基础；而总糖则是对各时期碳代谢产物的直接体现，上述酶及产物均能直接或间接地指示碳代谢在生育期内的走势及波动情况［21-24］。

烤烟从土壤中主要吸收和利用铵态氮、硝态氮2种不同形态的氮［25］。氮素形态具有较强的地域差异性，不同氮素形态对烤烟碳氮代谢酶的活性及总氮、总糖含量的影响不同［26-27］。杨春霞［28］、岳俊芹［17］等认为，单一氮源对烟株代谢的促进作用显著低于复合氮源，全铵处理的烟株后期SPS酶的活性较高，显著提高了向碳的积累代谢过渡的难度，不利于优质烟叶质量的形成；郭晓惠［18］、韦建玉［29］等认为，高比例的硝态氮对烤烟叶片总糖积累有促进作用，对NR、α-淀粉酶的活性有抑制作用，对总氮积累则无明显作用；而花蕊等［30］则指出，硝态氮不仅能促进水溶性总糖的积累，而且也能促进总氮的积累；谢晋等［31］则表示，硝态氮显著提高了碳的积累代谢，促进了总糖、还原糖等碳水化合物的积累，显著降低了氮代谢，抑制了总氮、烟碱等含氮化合物的积累；介晓磊［32］、Court［33］等认为，铵态氮能显著提高总糖含量，并且能显著降低总氮含量。

目前，对碳氮代谢的研究报道已经有很多，但所得结论仍不统一，一方面，可能是由于不同烤烟品种在不同区域种植，其体内自身碳氮代谢会存在一定的差异；另一方面，也可能是由于不同地区土壤理化性质差异导致了烤烟对不同形态氮的吸收存在差异，从而影响了碳、氮代谢。基于此，本试验在前人研究的基础上，挑选出3个典型的氮素形态配比，以K326为材料设置盆栽试验，全面阐明烤烟生育期内碳氮代谢酶的活性及总氮、总糖对不同铵硝配比的响应机制，为后期碳、氮这2种代谢的适时转化，实现烟叶优质、适产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点及供试材料

本研究于2019年11月至2020年3月，在云南省晋宁区宝峰镇大春河基地以K326为试验材料进行盆栽试验。所用肥料为云南省云天化集团提供的含巴斯夫硝化抑制剂（DMPP）的硫酸钾型复合肥（N-P2O5-K2O=13-10-22，铵硝比=7∶3）、钙镁磷肥（18% P2O5）、硫酸钾（50% K2O）、硝酸钾（N-P2O5-K2O=13.5-0-44.5）。盆栽土壤为未种植过作物的红色土，土壤的基本理化性质：有机质14.768 g/kg、全氮0.838 g/kg、碱解氮61.956 mg/kg、速效磷8.4762 mg/kg、速效钾66.312 mg/kg。

1.2 试验设计

设置铵硝比为7∶3、5∶5和3∶7的3个不同氮素形态配比的处理，其中各处理不足的硝态氮以硝酸钾补充、磷以钙镁磷肥补充、钾以硫酸钾补充，每株烟各肥料的施用量如表1所示。所选盆栽规格为：上直径为35 cm、盆高30 cm，每盆装土13 kg，控制施入纯氮8 g，N∶P∶K的质量比为1∶1∶2.5；基肥与追肥比为6∶4，基肥于移栽时完全拌土施入，追肥于移栽后40 d每盆兑1000 mL水一次性施入。其他栽培管理措施均按照优质烟叶生产规范要求。每个处理移栽60株，共计180株。

表1 各处理肥料施用的种类及其施用量 g/盆

1.3 测定方法

分别于烤烟移栽后45 d（旺长期）、70 d（打顶后1 d）和95 d（成熟期）对各处理随机取6株，取样部位为中部叶（第1次取样为从下往上数的第8叶，第2次和第3次为从下往上数的第11片叶，均距叶尖1/3的部位），取样后，切碎混匀，液氮保存备用，用于测定碳代谢酶（SPS、SS、SAI、α-淀粉酶）和氮代谢酶（NR、GS、GOGAT）的活性。测定方法采用试剂盒法，试剂盒购于苏州格锐思生物科技有限公司。此外，同时期另选6株，取相同叶位，105 ℃杀青、75 ℃烘干，由云南省同川农业分析测试技术有限公司测定各时期烟叶总氮、水溶性总糖的含量。

1.3.1 粗酶液的制备 将各处理取回的待测样品，准确称取1 g，置于预冷的研钵中，随后加入1 mL酶提取液，快速研磨至匀浆，完全转移到1.5 mL的离心管中，于4 ℃、12000 r/min下离心10 min，上清液即为酶粗液。

1.3.2 酶活性的测定 各类酶活性的测定均按照各自试剂盒内的试验操作步骤严格执行。其中，以每小时每克鲜重样品中催化产生1 nmol NO-的

2量定义为1个NR酶活力单位；每克组织在每分钟内使A540吸光值变化0.01定义为1个谷氨酰胺合成酶活性单位；每克组织每分钟生产1 nmol的谷氨酸定义为1个谷氨酸合成酶活性单位；37 ℃下每克组织每分钟产生1 μg还原糖定义为1个可溶性酸性转化酶活性单位；每毫升每分钟催化产生1 mg麦芽糖定义为1个α-淀粉酶活性单位；每克组织每分钟催化产生1 μg果糖定义为1个蔗糖合成酶活性单位；每克组织每分钟催化产生1 μg蔗糖定义为1个磷酸蔗糖合成酶活性单位。

1.4 数据分析

采用Excel 2019、SPSS 19.0软件制作图表及进行相关的统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同氮素形态配比对烤烟氮代谢关键酶活性的影响

2.1.1 对硝酸还原酶活性的影响 硝酸还原酶（NR）是氮代谢过程中的关键酶和限速酶。有研究表明，不同铵硝配比对NR酶的活性有显著影响，NR随施入硝态氮比例的升高而升高［21-24］。本试验结果也得出了相似结论（图1）：除移栽后70 d，铵硝比7∶3和3∶7处理的NR酶活性显著高于铵硝比5∶5处理外，其余处理时期均得出铵硝比3∶7处理的NR酶活性高于或显著高于铵硝比7∶3和5∶5处理的结论，即：高比例硝态氮施入量对NR的激活作用较高或显著较高。此外，随烟株生育期的延长，铵硝比7∶3和5∶5处理的烟叶NR酶的活性呈先升高后降低的趋势，而铵硝比3∶7处理的烟叶NR酶的活性则逐渐升高。

图1 不同氮素形态配比对烟株生育期内NR酶活性的影响

2.1.2 对谷氨酰胺合成酶及谷氨酸合成酶活性的影响 GS/GOGAT偶联循环是氨同化过程中的重要组成部分。有研究指出，参与循环的GS和GOGAT酶的活性与土壤中的铵态氮比例呈显著正相关关系［21-22］。图2显示，移栽45 d的烤烟叶片GS2和GOGAT酶的活性均以铵硝比7∶3处理最高，且铵硝比7∶3、5∶5处理的GS2酶活性无显著差异，铵硝比5∶5、3∶7处理的GOGAT酶活性无显著差异；移栽70、95 d的GS2和GOGAT酶活性均以铵硝比3∶7处理最高，其中，移栽70 d的GS2酶活性以铵硝比3∶7处理显著高于5∶5处理，而5∶5处理又显著高于7∶3处理；GOGAT酶的活性以铵硝比5∶5和3∶7处理显著高于7∶3处理，且5∶5、3∶7处理之间无显著差异。移栽95 d的GS2酶活性以铵硝比3∶7处理最高，铵硝比7∶3、5∶5处理之间无显著差异；GOGAT酶活性表现为铵硝比5∶5处理略低于3∶7处理，且两者的GOGAT酶活性均显著高于7∶3处理。此外，3个处理下的GS2、GOGAT酶活性在烟株生育期内的变化趋势各不相同，即：铵硝比7∶3处理下的叶片GS2、GOGAT酶活性均随生育期逐渐下降；而5∶5处理呈先升高后降低的趋势；3∶7处理的GS2酶活性逐渐升高，而GOGAT酶活性变化则与5∶5处理一致，呈先升高后降低的趋势。

图2 不同氮素形态配比对烟株生育期内GS2、GOGAT活性的影响

2.2 不同氮素形态配比对烤烟碳代谢关键酶活性的影响

2.2.1 对蔗糖合成酶活性的影响 蔗糖合成酶（SS）是衡量烟叶中内含物质充盈情况的关键指标［21-22］。图3显示，前期铵硝比7∶3和3∶7处理对SS酶活性的激活作用显著强于5∶5处理，但前两者的稳定作用不如后者；3个处理的SS酶活性均呈下降趋势，但5∶5处理的酶活性下降趋势更缓。具体来说：在移栽45 d时，铵硝比7∶3、3∶7处理的SS酶活性显著高于5∶5处理，且7∶3、3∶7处理之间无显著差异；移栽70 d的酶活性以铵硝比3∶7处理最高，7∶3、5∶5处理之间无显著差异；移栽95 d的酶活性以3∶7处理略高，但3个处理之间无显著差异。

图3 不同氮素形态配比对烟株生育期内SS酶活性的影响

2.2.2 对磷酸蔗糖合成酶活性的影响 磷酸蔗糖合成酶（SPS）在烟株体内的活性可用于衡量烤烟碳代谢的强弱及其变化规律［21］。由图4可知，自烤烟移栽45 d开始，3个处理的SPS酶活性就处于一个较低水平，甚至在移栽70 d时，还出现一个小的低峰值，而到移栽95 d时，SPS酶的活性明显升高。此外，在各时期，3个处理的叶片SPS酶活性均以铵硝比5∶5处理最高，以3∶7处理最低，且在移栽45 d和70 d时，铵硝比7∶3、3∶7处理之间的酶活性无显著差异；移栽95 d时，7∶3、5∶5处理之间无显著差异。

图4 不同氮素形态配比对烟株生育期内 SPS 酶活性的影响

2.2.3 对酸性转化酶活性的影响 酸性转化酶SAI是碳代谢为其他代谢提供必需碳骨架和能量的关键酶［21］。由本试验结果（图5）可知，3个处理下，前期的酸性转化酶的活性明显高于后期，呈缓慢下降的趋势，且在处理过程中，仅在移栽45 d时铵硝比7∶3处理的酸性转化酶的活性显著高于3∶7处理，其余时期铵硝比7∶3处理均显著高于5∶5、3∶7处理，而铵硝比5∶5和3∶7处理之间无显著差异。

图5 不同氮素形态配比对烟株生育期内酸性转化酶活性的影响

2.2.4 对α-淀粉酶活性的影响 α-淀粉酶活性的高低与烟株碳代谢的强弱及叶片内含物质积累情况息息相关［21-22］。由图6可见，在3种氮素形态供应模式下，α-淀粉酶的活性随烟株生育期的推进而呈先降低后升高的趋势。此外，在3个时期内，叶片α-淀粉酶的活性均以铵硝比3∶7处理的最高，以7∶3处理最低，且在移栽45、95 d时，铵硝比5∶5和3∶7处理的酶活性显著高于7∶3处理，而5∶5、3∶7处理之间无显著差异；而在移栽70 d时，α-淀粉酶的活性虽以铵硝比3∶7处理最高，但3个处理之间无显著差异。

图6 不同氮素形态配比对烟株生育期内α-淀粉酶活性的影响

2.3 不同氮素形态配比对烤烟总氮及总糖含量的影响

烟叶总糖及总氮分别是碳代谢和氮代谢的重要产物之一，两者在烟株各时期的含量是评价烟叶代谢活动强弱及走向的重要指标，同时，也是表征烤烟产质量的重要指标［20-22］。图7显示了各时期内烤烟叶片中水溶性总糖及总氮含量随不同硝铵比的变化规律，其中，3个处理的总氮含量均随生育期的进程而呈逐渐下降的趋势，总糖含量则呈上升的趋势，且移栽70 d以后，各处理烟叶内的总糖含量逐渐趋于稳定。同时，整个生育期内总氮含量对土壤氮素形态的响应均以铵硝比5∶5处理最高，7∶3、3∶7处理之间则无明显区别；总糖含量则以铵硝比7∶3处理最高，而3∶7处理的最低，且各处理之间均无显著差异。

图7 不同氮素形态配比对烟株生育期内叶片总氮、总糖含量的影响

3 讨论与结论

在优质烟叶形成的过程中，一般要求随烟株生育期的推进，烟叶中必须有含氮化合物代谢逐渐向碳水化合物代谢过渡的趋势。本研究结果表明，3个处理的NR活性在生育期内均呈先升高后降低的趋势，这符合后期氮代谢逐渐减弱的规律；此外，NR活性与硝态氮含量呈正相关或显著正相关关系，这与贾保顺［34］、杨志晓［24］、李成阳［35］、沈丽［36］等的研究结论一致。就GS2、GOGAT这2个酶的活性而言，其前期与铵态氮含量呈显著正相关关系，后期与铵态氮含量呈显著负相关关系，这与王玉霞［37］、李成阳［35］等的研究结果存在差异，其原因可能是在烟株根系发育基本完善的处理前期，根系可能更偏向于吸收耗能更少的铵态氮，这大大促进了根部GS1酶活性的提高，进而提高了氮的转运效率，从而促进了叶片中GS2、GOGAT酶活性的提高；而后期随生育期的进程及维管束结构的不断完善，土壤中铵态氮含量因硝化及根系的吸收也在不断减少，此时，土壤中的硝态氮可直接由维管束转运到叶片，从而大大提高了GS2、GOGAT酶的活性［38］。

此外，本研究还得出，铵硝比3∶7处理的烟株在生育后期有利于提高SS、α-淀粉酶的活性，并降低SPS酶的活性，从而有助于降低碳的转化及固定速率，并加速碳水化合物的积累，这表示适当提高硝态氮的施入比例，不仅对烟叶打顶后内含物质的充实有帮助，而且还有利于碳代谢与氮代谢两者之间的适时过渡和转化，这与Wang［27］、岳俊芹［17］等对烤烟的研究结论相似。同时，本试验也得出：生育期内转化酶及SS酶的活性均随生育期的推进而逐渐下降，但转化酶活性的下降幅度不及SS，这意味着处理后期蔗糖的分解由这2个酶同时催化，这与张新要等［19］得出的转化酶和SS在生育期内呈互补趋势的结论存在差异。除了氮素形态会影响碳氮代谢的强度及代谢进程外，还有水分、温度、光照等。胡亚杰等［39］认为，成熟期水分过多，延缓了烟叶碳代谢周期，有利于含氮化合物的积累；张森等［1］指出，低温会延长代谢周期，高温则会破坏叶绿素，使得碳代谢失调；云菲等［40］认为，遮阳会提高NR酶的活性，延长氮代谢周期。上述研究表明，植物体内的碳氮代谢酶的活性对氮素形态的响应差异还可能会受到其他环境因素的影响。

本试验结果表明，各处理的总糖含量与铵态氮比例呈正相关关系，总氮含量以铵硝各占一半时最高，但它们对氮素形态的响应差异不显著。在本试验条件下，综合碳氮代谢的协调性及烤烟优质烟叶对内在质量的要求来看，以铵硝比3∶7处理的综合得分最高，即：施用较高比例的硝态氮有利于烟株碳氮代谢协调运作及后期碳代谢和氮代谢的适时转化，可考虑在生产上推广应用。