Lnc-AK077216基于OPG/RANKL/RANK通路对破骨细胞分化成熟的调控作用

李坤，喻锋，余国庆，陈志龙，王晶

（鄂州市中心医院 骨科，湖北 鄂州 436000）

人体中骨代谢的稳定性由骨重建维持，包括成骨细胞（Osteoblast,OB）介导的骨形成、破骨细胞（Osteoclast,OC）介导的骨吸收[1]。当骨重建平衡被打破，骨量将异常减少或增加，导致骨质疏松、骨关节炎、佩吉特病等骨破坏性疾病，其中骨质疏松发病率居首位，严重降低患者生活质量[2]。目前骨质疏松治疗以基础药物、抗吸收药物、骨生成药物为主，但前两类药物无诱导骨生成能力，且安全性有待提升，骨生成药物可刺激骨生成，但容易导致内分泌紊乱。故进一步探讨新型治疗方式以改善骨质疏松疗效具有必要性。OC是机体中唯一具有骨吸收作用的细胞，目前调节OC活性被认为是治疗骨质疏松较为直接、有效的方式。长链非编码RNA（long noncoding RNA,LncRNA）是新发现的一类非编码RNA分子，几乎参与mRNA转录、拼接、降解、翻译等全部过程，已有国内外研究证实其异常表达与OC活性关系密切[3-5]。但目前鲜有关于Lnc-AK077216对OC分化成熟的调控作用及具体机制的研究。鉴于此，本研究通过建立敲低Lnc-AK077216的RAW264.7细胞模型，探讨Lnc-AK077216对OC分化成熟的调控作用，并探讨相关调控机制，为骨质疏松治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂及仪器

RAW264.7小鼠单核巨噬细胞（中国科学院细胞库）。MEMα培养基（上海康朗生物科技有限公司），胎牛血清、DMEM培养基（美国Thermo Fisher Scientific公司），磷酸盐缓冲液（PBS）[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]，Trizol试剂盒（北京柏莱斯特科技发展有限公司），RT-Kit逆转录试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]，QIAGEN208054荧光定量试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]，抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色试剂盒（美国Sigma公司），Bradford蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司），ECL化学发光检测试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司），6XD-3光学显微镜（上海光学仪器一厂），BX61型荧光显微镜（日本Olympus株式会社），实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）仪、ChemiDoc XRS化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染RAW264.7细胞培养于MEMα培养基（含10%胎牛血清、1%双抗），于37℃、5%二氧化碳培养箱中传代培养。取对数生长期细胞经胰蛋白酶消化，以8×104个/mL接种于24孔板，置于培养箱中继续培养。观察细胞生长状态，当融合度达到50%左右时，吸弃上层培养液，PBS洗涤2次。按照脂质体转染法操作说明书进行转染，转染Lnc-AK077216-shRNA、ControlshRNA的细胞分别设为转染组和空载组。每孔板加入2 mL高糖DMEM培养液（含20%胎牛血清，不含抗生素），继续培养48 h，荧光显微镜下观察感染率。未经处理的RAW264.7细胞设为对照组。每组设置5个复孔。

1.2.2 转染后Lnc-AK077216 mRNA相对表达量检测采用qRT-PCR法检测空载组和转染组的Lnc-AK077216 mRNA相对表达量。收集转染48 h后的RAW264.7细胞，Trizol试剂盒提取细胞总RNA，取2μg样本逆转录获取cDNA。采用琼脂糖凝胶电泳法对产物进行鉴定，实施qRT-PCR。按照QIAGEN208054荧光定量试剂盒说明书设置反应体系：2×SYBR Green Master Mix 10.5μL，正反向引物各0.7μL（10μmol/L），cDNA 1μL，dd H2O 7.6μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性25 s，60℃退火20 s，72℃延伸60 s，重复40个循环。Lnc-AK077216正向引物：5'-TGACAGTGCGCATGAGTGC CACGT-3'，反向引物：5'-TGTGGACGTGACGCACG TCTATGC-3'；β-actin正向引物：5'-CCAGATGCCG TGACGGCACAAGTC-3'，反向引物：5'-TGAACTCG TACCATACCGTGCGCA-3'。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。所有实验重复3次求Ct均值。

1.2.3 TRAP染色取对数生长期RAW 264.7细胞以1.5×104个/孔接种于96孔板，待细胞铺满底部时采用DMEM高糖培养基（含100 ng/mL RANKL）进行诱导分化，隔天换液，7 d后行TRAP染色。移除孔中培养液，用PBS洗3次后吸除干净；室温下用4%多聚甲醛固定液固定20 min，用PBS洗3次后吸除干净；加入配置好的TRAP染色液，置于37℃孵箱中孵育40 min；弃去培养液，加入PBS 100μL/孔，显微镜下观察染色情况并计数，以≥3个细胞核，且TRAP染色阳性为OC鉴定标准；使用IPP软件统计视野下TRAP阳性染色面积，每孔随机选取3个视野求均值。

1.2.4 各组细胞骨保护蛋白（OPG）/细胞核因子κB受体活化因子配体（RANKL）/细胞核因子κB受体活化因子（RANK）mRNA相对表达量检测收集各组诱导分化培养3 d的细胞，提取、鉴定总RNA方式及qRT-PCR法同1.2.2。OPG正向引物：5'-TTGTACGTT GCACGCCAGTGCACG-3'，反 向 引 物 ：5'-TACAACCAACTGCCACGTTGCACG-3'；RANKL正 向引物：5'-ACCGTGTCACGTTGCACTGCACGT-3'，反向引 物：5'-GTGACTCCAGTGCCGTGCATGCCA-3'；RANK正向引物：5'-CTGACGTGCACGTGCCACGTGG CA-3'，反向引物：5'-ATTGGAAACGGCACTTGAACTG CA-3'；β-actin正向引物：5'-TGACTGGCAGTCAGCA TGCGTGGC-3’，反向引物：5'-TGTACGTGCACGTGC CACGGCCAC-3'。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。所有实验重复3次求Ct均值。

1.2.5 各组细胞OPG、RANKL、RANK蛋白相对表达量检测采用Western blotting检测各组细胞OPG、RANKL、RANK蛋白相对表达量。取各组诱导分化培养3 d的RAW264.7细胞，冰上操作，经预冷PBS洗涤2次，弃去PBS。加入蛋白裂解液，置于离心管，冰上裂解30 min，4℃13 000 r/min离心15 min（离心半径为8 cm），取上清液，使用Bradford蛋白定量试剂盒进行检测。取50μg样品加入5×SDSPAGE上样缓冲液，沸水浴5 min。冰上冷却后以恒定电压进行聚偏二氟乙烯膜转膜，转膜后加入50 g/L脱脂奶粉，室温摇床孵育2 h。将封闭好的聚偏二氟乙烯膜置入杂交袋，加入一抗（1∶1 000）室温孵育过夜，TBTS漂洗15 min×3次。再次将聚偏二氟乙烯膜置入杂交袋，加入二抗（1∶8 000）室温孵育1 h后TBTS漂洗10 min×3次。将ECL A、B液等量混合，放入聚偏二氟乙烯膜，孵育10 s，吸除膜上发光液，采用ECL化学发光成像系统对目的条带进行检测，以OPG、RANKL、RANK蛋白灰度值/内参β-actin灰度值表示蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 24.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAW264.7细胞转染率

转染48 h后，荧光显微镜下观察同一视野里RAW264.7细胞转染情况，转染率＞70%。见图1。

图1 荧光显微镜下观察RAW264.7细胞转染率（×100）

2.2 转染后细胞Lnc-AK077216 mRNA相对表达量下降

转染48 h后对照组、空载组、转染组细胞Lnc-AK077216 mRNA相对表达量分别为（0.74±0.08）、（0.71±0.09）、（0.47±0.05），经方差分析，差异有统计学意义（F=19.324，P=0.000），转染组Lnc-AK077216 mRNA相对表达量均低于对照组和空载组（P＜0.05）；对照组与空载组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 转染后各组Lnc-AK077216 mRNA相对表达量（±s）

2.3 诱导分化RAW 264.7细胞后的形态学变化

诱导分化前RAW264.7细胞多呈圆形且形态规则，诱导分化7 d后经TRAP染色，可观察到呈阳性的多核巨细胞，细胞有伪足、突起，且体积较大，表明生成OC。见图3。

图3 RAW 264.7细胞诱导分化前、诱导分化7 d后TRAP染色结果（×100）

2.4 各组OC数、阳性染色面积比较

各组OC数、阳性染色面积比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），转染组OC数少于对照组和空载组（P＜0.05），阳性染色面积小于对照组和空载组（P＜0.05）；对照组与空载组OC数、阳性染色面积比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1和图4。

表1 各组OC数、阳性染色面积比较（±s）

表1 各组OC数、阳性染色面积比较（±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与空载组比较，P＜0.05。

组别对照组空载组转染组F值P值OC数/个237.58±29.97 235.01±30.14 106.86±11.25①②43.344 0.000阳性染色面积/μm2 322 567.56±42 561.32 311 635.12±46 964.21 207 561.20±25 682.94①②12.924 0.000

图4 各组细胞TRAP染色结果（×100）

2.5 各组细胞OPG、RANKL、RANK mRNA相对表达量比较

各组细胞OPG、RANKL、RANK mRNA相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），转染组OPG mRNA相对表达量高于对照组和空载组（P＜0.05），RANKL、RANK mRNA相对表达量低于对照组和空载组（P＜0.05）；对照组和空载组OPG、RANKL、RANK mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组细胞OPG、RANKL、RANK mRNA相对表达量比较（±s）

表2 各组细胞OPG、RANKL、RANK mRNA相对表达量比较（±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与空载组比较，P＜0.05。

组别对照组空载组转染组F值P值OPG mRNA 0.46±0.05 0.48±0.07 0.71±0.08①②20.978 0.000 RANKL mRNA 0.62±0.08 0.59±0.06 0.32±0.04①②35.302 0.000 RANK mRNA 0.70±0.08 0.69±0.09 0.42±0.05①②22.265 0.000

2.6 各组细胞OPG、RANKL、RANK蛋白相对表达量比较

各组细胞OPG、RANKL、RANK蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），转染组OPG蛋白相对表达量高于对照组和空载组（P＜0.05），RANKL、RANK蛋白相对表达量低于对照组和空载组（P＜0.05）；对照组和空载组OPG、RANKL、RANK蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3和图5。

表3 各组细胞OPG、RANKL、RANK蛋白相对表达量比较（±s）

表3 各组细胞OPG、RANKL、RANK蛋白相对表达量比较（±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与空载组比较，P＜0.05。

组别对照组空载组转染组F值P值OPG蛋白0.51±0.06 0.49±0.05 0.82±0.09①②36.162 0.000 RANKL蛋白0.79±0.08 0.78±0.09 0.35±0.06①②52.293 0.000 RANK蛋白0.85±0.09 0.82±0.07 0.41±0.05①②58.484 0.000

图5 各组细胞OPG/RANKL/RANK通路蛋白表达

3 讨论

骨质疏松好发于老年群体，研究认为高龄、内分泌异常、肥胖、偏食、缺乏运动、遗传等均为其发生的危险因素[6-7]。骨质疏松的直接病因是OC过度激活或破骨前体细胞向OC过度分化，导致骨吸收过程加速，并以骨组织显微结构变化、骨量降低等为主要病理改变[8]。OC经过细胞成熟和极化，骨吸收面细胞中生成肌动蛋白环，促使细胞膜形成微皱褶，与骨表面形成封闭区域，进而发挥骨吸收功能，参与骨质疏松进程。因此，研究影响OC分化活性的基因对于骨质疏松治疗具有重要意义。

本研究发现，转染组Lnc-AK077216 mRNA相对表达量低于对照组和空载组；转染组OC数少于对照组和空载组，TRAP阳性染色面积小于对照组和空载组，提示敲低LncRNA-AK077216可显著抑制RAW264.7细胞向OC分化。LncRNA具有基因表达调控功能，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学行为过程[10]。WANG等[11]表明，LncRNA LINC00311可通过调控Notch信号通路促进骨质疏松模型大鼠中OC的增殖、分化。洪宇桁等[12]研究证实，LncRNA NEAT1在OC分化过程中过表达，且可促进OC分化并抑制OB分化进而诱发骨质疏松。表明调控LncRNA可能作为影响OC分化的途径之一。Lnc-AK077216可通过介导相关信号通路调控OB形成，其异常表达可影响破骨前体细胞向OC分化的活性，导致骨量紊乱。本研究结果显示，诱导后OC数量减少。由此可见，敲降Lnc-AK077216可显著阻断RAW264.7细胞向OC分化的过程，该基因可能成为骨质疏松治疗的潜在靶点。

本研究结果提示敲低Lnc-AK077216对RAW264.7细胞向OC分化的抑制作用可能与调控OPG、RANKL、RANK表达有关。OPG/RANKL/RANK信号通路是近年来发现的OC分化过程中重要的信号传导通路，该通路被激活后可延缓OC凋亡，通过复杂的机制促进骨基质吸收，引发骨质疏松[13-14]。破骨前体细胞或OC细胞表面RANK与RANKL结合后，介导信号激活破骨前体细胞向成熟OC分化，并抑制OC凋亡[15]。OPG可竞争性结合RANKL，阻断RANKL与RANK结合，抑制破骨前体细胞分化，促使成熟OC凋亡。LIU等[16]研究证实，Lnc-AK077216可促进NFATc1表达，而NFATc1是OC形成过程中必需的转录因子，且去卵巢小鼠骨髓中Lnc-AK077216、NFATc1表达均上调。而NFATc1是RANKL/RANK信号系统下游关键转录因子[17]，故结合本研究结论推测Lnc-AK077216可通过介导OPG/RANKL/RANK信号通路影响OC分化。

综上所述，敲低Lnc-AK077216可抑制RAW264.7细胞向OC分化，其调控机制可能与上调OPG mRNA及蛋白表达，下调RANKL和RANK mRNA及蛋白表达有关，提示Lnc-AK077216基因及其靶蛋白OPG、RANKL、RANK可能成为骨质疏松及其他骨破坏相关疾病治疗的潜在靶点，为临床治疗提供理论依据。Lnc-AK077216对OC分化的调控可能存在其他机制，仍需进一步研究。