畜禽消化道健康五环标准之—— 物理屏障

■杨小军 雷新建 王佳堃 孔祥峰 苏 勇 曾祥芳 刘作华 姚军虎*

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.浙江大学动物科学学院，浙江 杭州 310058；3.中国科学院亚热带农业生态研究所，湖南 长沙 410125；4.南京农业大学动物科技学院，江苏 南京 210095；5.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；6.重庆市畜牧科学院，重庆 402460）

消化道是动物机体消化吸收营养物质的主要场 所，其形态结构的完整性是保证营养正常吸收的基础。消化道上皮细胞按照单层有序排列，对肠腔内的物质进行选择性透过，实现营养物质的流动过程。伴随食物进入消化道内的杂质和致病原直接与消化道接触，物理屏障在保证消化道对食物中营养物质消化吸收的同时，维持消化道通透性，阻隔有害物质或病原微生物进入机体内部。消化道物理屏障受损可能导致有害物质和微生物进入动物血液，危害机体健康。因此，完整的物理屏障对养分摄入和机体健康有重要作用。消化道物理屏障分为增加营养物质吸收面积的乳头、绒毛与隐窝等组织形态学结构，维持消化道通透性的细胞紧密连接，以及缓冲隔离食糜、覆盖上皮细胞的黏液层。文章对畜禽消化道物理屏障的功能与影响因素展开综述，结合Meta 分析探究评价畜禽胃肠道物理屏障的测定指标，并提供相关指标的健康范围，以期为畜禽消化道健康的物理屏障评估提供指标和参数支撑。

1 消化道物理屏障及其影响因素

1.1 瘤胃乳头

瘤胃是高效降解碳水化合物的天然生物反应器，含有多种细菌、真菌、古细菌、原生动物，是保障养分利用和机体健康的基础。幼龄反刍动物的瘤胃体积小，发育不完全，且不具备纤维消化功能，瘤胃乳头高度和上皮固有层厚度均随日龄的增加而逐步提高。瘤胃形态和功能的完善是幼龄反刍动物发育成熟的重要标志之一。成年反刍动物瘤胃内壁出现大量乳头状突起，既可增加瘤胃内壁表面积，增强瘤胃对挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）等营养物质的吸收能力；又能增加代谢产物从瘤胃上皮进入毛细血管的速率来促进代谢活动；此外还具有一定的免疫保护功能。瘤胃乳头最外层是由完全角质化的细胞构成的角质层，可保护乳头免受瘤胃食糜的磨损侵蚀，同时角质化程度也直接影响瘤胃乳头对营养物质的吸收。

瘤胃乳头是反映瘤胃健康的形态学基础，而营养素是调节瘤胃乳头发育的主要因素之一。高精料水平的饲粮可显著降低瘤胃乳头的上皮总厚度，但过量的淀粉精料反而对瘤胃乳头的发育不利。VFA 为瘤胃乳头发育提供必需的营养物质，丁酸可调控上皮细胞增殖和凋亡，增加瘤胃乳头的生长速度。丙酸和乙酸也能促进乳头发育，但效果弱于丁酸。热应激会增加反刍动物精饲料的采食量，其中淀粉摄入量的加大使得动物的瘤胃乳头高度有所增加，并对瘤胃乳头上皮的角质层有一定程度的损伤。瘤胃上皮对营养物质的吸收转运很大程度上依赖于角质层细胞的角质化程度。高浓度营养饲粮水平能增加瘤胃上皮基底层细胞数量，基底层细胞分化向上迁移，引起颗粒层和棘层细胞数量增加，从而促进瘤胃上皮乳头的发育。但当反刍动物发生亚急性瘤胃酸中毒时，瘤胃pH 快速下降导致内毒素和组胺的形成，刺激瘤胃上皮出现炎症，加重瘤胃上皮细胞的损伤。高精料日粮山羊瘤胃角质层脱落明显，角质层细胞和颗粒层之间的黏附受到损害，破坏瘤胃上皮的形态结构，进而影响其屏障功能。

1.2 肠道绒毛与隐窝

肠上皮细胞有序内陷形成隐窝，上有指状细小突起为肠道绒毛，形成了小肠的主要形态结构，极大增加了营养物质消化吸收的面积。肠道绒毛高度（vil⁃lus height，VH）是反映小肠消化和吸收能力的主要指标，VH 增加，肠道的吸收面积增大。隐窝深度（crypt depth，CD）体现肠道细胞的生成速度，通常较浅的CD意味着更快的细胞成熟率和更强的营养吸收功能。肠道绒毛高度/隐窝深度（VH/CD）是评估小肠吸收能力的重要参数，VH/CD降低则预示着黏膜损伤和营养吸收能力下降。

研究表明多种添加剂可通过促进肠道发育和完善消化道屏障进而促进营养物质的吸收利用，改善生长性能。日粮中补充苏氨酸可提高肉仔鸡肠道VH，进而减轻注射脂多糖诱导的炎症反应。在肉鸡日粮中添加谷氨酰胺可增加十二指肠和空肠的VH和表面积。Hamid 等（2018）研究发现，酸化饮水可显著提高肉鸡空肠VH，并改善肉鸡生产性能。胡贵丽等（2018）研究发现，饲粮中添加博落回生物碱显著提高黄羽肉鸡空肠VH 和VH/CD。肠上皮细胞在发挥营养吸收功能的同时，自身细胞代谢也相对旺盛，对能量需求较大。食糜中结构性多糖（包括可溶性膳食纤维、低聚糖、抗性淀粉等）可在肠道微生物的发酵下生成短链脂肪酸，直接被肠上皮细胞作为营养物质吸收，促进肠道发育，保障物理屏障功能正常。Tian 等（2018）发现日粮补充低聚半乳糖能显著降低21日龄仔猪空肠CD。田时祎等（2018）研究发现，早期灌喂低聚半乳糖显著提高仔猪回肠VH/CD。消化道疾病的发生往往伴随着肠道形态学结构的病变，隐窝细胞增殖和上皮细胞凋亡之间的平衡改变导致肠绒毛萎缩和隐窝增生，从而导致营养吸收表面的损失。感染球虫病肉鸡的肠道炎症导致绒毛坏死，其特征是VH/CD 降低、隐窝扩张和杯状细胞减少。在热应激状态下，肉鸡空肠VH 下降，CD 增加，VH/CD 降低。Ma 等（2020）研究发现日粮补充酵母细胞壁显著提高犊牛回肠的VH 和VH/CD。Zhang 等（2020）发现用淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌喂养断奶山羊可促进瘤胃乳头和小肠绒毛的生长。Costa 等（2019）发现日粮添加甘露聚糖显著提高犊牛空肠VH。

1.3 紧密连接与通透性

肠上皮的一个重要作用是将管腔内容物与间质分开，这一功能的发挥主要依赖肠上皮的完整性和细胞旁空间的紧密连接。肠上皮细胞间的连接方式包括桥粒（desmosome）、半桥粒（hemidesmosome）、黏附连接（adherence junction）、间隙连接（gap junction）和紧密连接（tight junction）等多种形式。其中紧密连接是肠道上皮细胞之间的主要连接方式，也是调节肠道黏膜通透性和屏障功能的关键结构。紧密连接通过连接复合体中的闭合蛋白（Claudins）和其他蛋白质结构调节水、离子和小分子的流动。紧密连接复合体由膜内蛋白、封闭蛋白和闭合蛋白家族的不同成员组成。与紧密连接相关的蛋白质包括跨膜蛋白和细胞骨架蛋白。跨膜蛋白包含了咬合蛋白（Occludin，OCLN）家族、闭合蛋白（Claudin，CLDN）家族和连接黏附分子（Junction adhesive molecule，JAM）家族，细胞骨架蛋白仅包含闭合小环蛋白（Zonula occludens，ZO）家族。OCLN家族是经典的肠上皮细胞紧密连接蛋白，可封闭细胞间隙，过滤小分子和大分子物质。CLDN 家族包含24 种蛋白，有4 个跨膜区和2 个胞外环状结构，作为紧密连接的整合蛋白参与屏障大小选择性地调节。JAM家族共有4种蛋白，在内皮和上皮中均有紧密连接作用。JAM-2特异性定位于细胞-细胞连接处并在同型紧密连接处富集表达，具有调节内皮和上皮细胞通透性、白细胞募集、细胞增殖等多种功能。ZO 家族在维持上皮细胞屏障功能的基础上，还在维持上皮极性和细胞物质转运中发挥重要功能。

早期移植母猪的粪菌可降低仔猪血浆中内毒素和二胺氧化酶（diamineoxidase，DAO）的浓度，降低肠道通透性。低聚半乳糖可提高哺乳仔猪空肠ZO-1和Claudin-1 的基因表达，提高新生哺乳仔猪空肠组织中ZO-1 的蛋白表达，改善肠道屏障功能。凝结芽孢杆菌可降低仔猪血浆中DAO 浓度。添加粪肠球菌NCIMB 11181 可提高肉鸡紧密连接蛋白CLDN-1 的基因表达量，同时提高空肠中Claudin-1 蛋白的表达。补饲紫丁香苷显著增加了猪空肠上皮细胞CLDN-3、OCLN 和ZO-1 的mRNA 和蛋白表达。另一方面，色氨酸可增加断奶仔猪血清DAO 活性和内毒素浓度，降低断奶仔猪回肠中OCLN、ZO-1 和CLDN-1 的丰度，并降低断奶仔猪回肠中OCLN、ZO-1 和CLDN-1的mRNA表达。大豆凝集素显著降低仔猪小肠上皮细胞跨上皮电阻值，提高碱性磷酸酶活性，增加通透性，并降低OCLN 和CLDN-3 的蛋白表达水平。当动物处于应激状态或患有肠道炎症时，少量的肠腔内毒素、共生微生物和病原体可能穿过上皮并通过紧密连接进入循环，病原体还可以刺激免疫和肠上皮细胞局部分泌促炎细胞因子。这些炎症和应激反应可能通过肌球蛋白轻链激酶诱导肌球蛋白轻链磷酸化，导致肠上皮紧密连接的收缩和开放以及肠通透性增加。

2 益生与应激处理对肠道物理屏障影响的Meta分析

2.1 文献检索与筛选

此次Meta 分析的文章采用网络数据库进行电子检索，共包含CNKI、Science Direct、Pub Med、Web of Science 四个数据库来源。目标文献的研究类型为探究益生或应激处理对动物消化道物理屏障影响的试验性论文。检索与纳入文章的筛选条件包括：试验对象为猪、蛋鸡、肉鸡、牛或羊；试验处理为饲料改良、益生菌添加等益生处理或热应激、饥饿、添加致病菌等应激处理；试验设计中须包含健康动物正常饲喂的空白对照组；试验结果包含瘤胃乳头长度、宽度、表面积和肌层厚度，肠道VH、CD 或VH/CD，血液内毒素、D-乳酸、异硫氰酸荧光素（FITC-d）或DAO含量；胃肠道上皮OCLN、CLDN、JAM、ZO 或黏蛋白（MUC）蛋白家族的基因表达量等指标。

2.2 数据提取

从纳入文章中获得试验动物、试验处理、样本类型、检测值等原始数据。按照不同动物的应激或益生处理分组进行Meta分析，组内包含文献少于3篇时舍弃分组。紧密连接蛋白同基因家族中选纳入文章数量最多的基因进行Meta 分析。检测值包括平均值（mean）、标准差（SD）和样本量（n），当文章误差以标准误（SE）呈现时可按公式换算为SD值。

SD=SE×n

按消化道不同部位划分亚组，同一亚组中有多个处理的按公式合并。

式中：k——处理数；

mi、SDi和ni——分别为第i个处理的平均数、标准差和样本量。

2.3 统计学分析

计算瘤胃乳头和肠道绒毛的健康范围时，将对照和益生组的平均值录入SPSS 24.0 软件，按n值进行个案加权后进行数据的正态性检验和描述性统计：当数据符合正态分布时，取95%置信区间（CI），当数据不符合正态分布时，取上下四分位数作为健康范围的参考值。

Meta 分析使用Stata 15.1 软件，所有结果指标为连续型变量，使用随机效应模型（random effect，RE）和标准均值差（standard mean difference，SMD）算法进行标准化处理后计算合并效应值和95%CI，采用U检验，当P≤0.05 时认为益生或应激处理显著影响该指标。

2.4 瘤胃乳头Meta分析结果（见表1、表2）

表1 瘤胃乳头相关指标的Meta分析

表2 瘤胃乳头相关指标的健康范围

筛选到64 篇文献符合Meta 分析要求：其中乳头表面积10篇，肌层厚度16篇，乳头宽度45篇，乳头长度52篇。由表1可见，瘤胃乳头表面积不随益生处理发生显著变化（P>0.05），牛的瘤胃肌层厚度、乳头宽度和乳头长度在益生处理后均显著提高（P<0.05），而益生处理对羊的肌层厚度和乳头宽度均无显著影响（P>0.05），仅瘤胃乳头长度在益生处理后显著提高（P<0.05）。瘤胃乳头相关指标的健康范围见表2。综合Meta 分析结果发现，在粗饲料、热应激、pH 的多重调控下，瘤胃乳头表面积、肌层厚度、乳头长度和宽度，作为肠道物理屏障的重要评价指标，其数值大小与肠道健康程度有重要的相关性，应当将其作为评估肠道健康的指标，纳入物理屏障的评价体系之中。

2.5 肠道绒毛与隐窝Meta分析结果

在四个数据库共筛选出符合Meta 分析要求的文献527篇：其中VH 527篇，CD 508篇，VH/CD 397篇。由表3 和图1（a、c、e）可见，益生处理显著增加猪、肉鸡、蛋鸡、羊、牛肠道VH（P<0.05），显著降低猪、肉鸡肠道CD（P<0.05），显著增加猪、肉鸡、蛋鸡肠道VH/CD（P<0.05），对牛、羊肠道VH/CD 没有显著影响（P>0.05）。应激处理显著降低猪、肉鸡、牛的肠道VH（P<0.05），显著增加猪肠道CD（P<0.05），显著降低猪、肉鸡肠道VH/CD（P<0.05），但对蛋鸡、牛、羊肠道CD 没有显著影响（P>0.05）。从漏斗图（图1b、d、f）可见益生处理后合并效应值左右两侧文章分布对称，表明Meta 分析结果稳健。不同肠段的亚组分析结果见表4～表6。所用数据均不符合正态分布，因此选用四分位法Q25和Q75做指标健康范围，结果见表7。Me⁃ta 分析结果表明，肠道VH 是评价畜禽肠道物理屏障的重要指标，而肠道CD 与VH/CD 是评估单胃动物肠道物理屏障的重要指标，应当将其作为评估肠道物理屏障的指标。

表3 肠道绒毛相关指标的Meta分析

表4 不同肠段VH的亚组分析

表5 不同肠段CD的亚组分析

表6 不同肠段VH/CD的亚组分析

表7 肠道绒毛相关指标的健康范围

图1 益生处理对羊肠道绒毛相关指标的影响

2.6 紧密连接与黏蛋白Meta分析结果

紧密连接蛋白与黏蛋白的相对表达量在四个数据库中共筛选出400 篇文献纳入Meta 分析，其中包括：OCLN-1（273篇）、ZO-1（230篇）、CLDN-1（188篇）、MUC-2（121 篇）、ZO-2（30 篇）、CLDN-3（30 篇）、CLDN-2（25 篇）、CLDN-4（21 篇）、JAM-2（17 篇）、CLDN-5（8篇）、JAM-1（6篇）。选取各基因家族纳入文章最多的基因进行Meta 分析，由表8 和图2 可知，所有紧密连接蛋白和黏蛋白基因的表达规律相同：应激条件下基因表达下调，益生条件下基因表达上调。其中益生或应激处理对猪、肉鸡、牛、羊OCLN-1基因和ZO-1 基因的表达量有显著影响（P<0.05）；处理仅对猪和肉鸡CLDN-1 基因表达有显著影响（P<0.05），而对蛋鸡、牛、羊CLDN-1 基因表达没有显著影响（P>0.05）；处理对猪、蛋鸡、肉鸡MUC-2 基因表达有显著影响（P<0.05）；JAM-2 纳入文献较少，处理对肉鸡的JAM-2 表达没有显著影响（P>0.05）。漏斗图中应激处理对OCLN-1（图2b）、ZO-1（图2f）和CLDN-1（图2j）表达量的合并效应值两侧文章分布不对称，可能是由于应激处理的类型不同对相关蛋白的表达量影响不一；而益生处理下漏斗图左右对称（图2d、h、l），可靠性强。不同处理下动物在各肠段中紧密连接蛋白和黏蛋白表达量差异的亚组分析结果在表9～表13 中展示。结合Meta 分析结果，评估动物肠道屏障功能时可将紧密连接蛋白相关基因，如OCLN-1、ZO-1、CLDN-1、MUC-2 等作为评估肠道物理屏障的指标。

图2 不同处理对羊胃肠道紧密连接蛋白的影响

表8 肠道紧密连接蛋白和黏蛋白基因表达量的Meta分析

表9 不同肠段OCLN-1基因表达量的亚组分析

表10 不同肠段ZO-1基因表达量的亚组分析

表10（续） 不同肠段ZO-1基因表达量的亚组分析

表11 不同肠段CLDN-1基因表达量的亚组分析

表12 不同肠段JAM-2基因表达量的亚组分析

表13 不同肠段MUC-2基因表达量的亚组分析

2.7 通透性的Meta分析结果

肠道通透性文献筛选后共147 篇符合Meta 分析要求，其中包括：内毒素（23 篇）、D-乳酸（53 篇）、FITC-d（19 篇）、DAO（52 篇）。由Meta 分析结果（表14）可见，应激处理显著提高肉鸡血液内毒素水平（P<0.05），益生处理不影响猪血液内毒素水平（P=0.283）。益生处理显著降低猪血液D-乳酸水平（P<0.05），应激处理显著提高肉鸡血液D-乳酸水平（P<0.05）。应激处理显著提高肉鸡血液FITC-d水平（P<0.05），但益生处理不影响肉鸡血液FITC-d水平（P=0.136）。应激处理显著提高猪、肉鸡血液DAO 水平（P<0.05），益生处理显著降低猪、肉鸡血液DAO 水平（P<0.05）。综合Meta 分析结果发现，肠道通透性（内毒素、D-乳酸、FITC-d或DAO 等）是评价消化道物理屏障的有效指标。

表14 肠道通透性的Meta分析

3 结论

完整的物理屏障是消化道健康的重要标志之一，用瘤胃乳头长度、肠道VH、CD、VH/CD和紧密连接蛋白与黏蛋白表达、肠道通透性等指标评估畜禽胃肠道物理屏障功能具有可行性。其中，瘤胃乳头长度能够反映反刍动物消化道的健康状态，肠道CD、VH/CD能够反映猪和肉鸡肠道的健康状态，肠道VH、紧密连接蛋白与黏蛋白表达以及肠道通透性指标能够反映畜禽肠道的健康状态。