4种中药单体对抗原提呈细胞免疫激活作用的研究

路冉 王爽 王斌

(青岛大学基础医学院，山东 青岛 266071)

先天性免疫系统在机体受到病原体感染时会快速启动，并产生炎症反应，同时激活适应性免疫系统，这是保护机体的第一道重要免疫防线[1]。先天免疫细胞还可以通过靶向激活受体或者通过阻断抑制通路，或者与适应性免疫的相互作用来实现抗肿瘤功能[2]。鉴于先天免疫的重要性，关于如何激活先天免疫，以及寻找新的抗原提呈细胞(APCs)的激活剂成为抗肿瘤相关研究的热点[3-4]。黄酮类是一类具有C6-C3-C6结构的天然多酚类化合物，且具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗炎、抗氧化、防治神经紊乱以及免疫调节等作用[5-6]；而且由于其毒副作用小、易获取等特点[7]，具有作为疫苗佐剂的条件和潜力，因此也是目前佐剂研究的热点。研究发现，黄酮类化合物白杨素、蔓荆子黄素、刺芒柄花素和北美圣草素均具有免疫调节作用[8-10]，但关于这4种中药单体激活APCs的能力的相关研究目前报道较少，因此本研究旨在通过检测这4种中药单体在细胞水平上对APCs的激活作用，以筛选出具有免疫激活作用的中药单体，为肿瘤相关疫苗佐剂研发提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 细胞、仪器与试剂

白杨素(纯度≥98%)、蔓荆子黄素(纯度≥98%)、刺芒柄花素(纯度≥98%)和北美圣草素(纯度≥98%)均购自大连美仑生物科技有限公司；流式抗体PE anti-mouse CD80、PE anti-mouse CD86、PE anti-mouse主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)及PE anti-mouse I-A/I-E均购自美国Biolegend公司；小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞系购自中国科学院上海细胞资源中心；小鼠骨髓来源树突状细胞DC2.4细胞系由本实验室保存。

1.2 细胞培养

RAW264.7细胞和DC2.4细胞分别接种于含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中传代培养，待细胞培养2～3代状态稳定后，用于后续实验。

1.3 药物的溶解和配制

蔓荆子黄素、刺芒柄花素和北美圣草素分别以二甲基亚砜进行溶解，制备成浓度为20、25、40 g/L的母液，白杨素以乙醇进行溶解，制备成浓度4 g/L的母液。将每种中药单体的母液再以含体积分数为0.10胎牛血清的DMEM培养基进行稀释，分别配制成低、中、高3个浓度，白杨素的终浓度为10、20、40 mg/L，蔓荆子黄素为0.1、1、10 mg/L，刺芒柄花素为0.25、2.5、25 mg/L，北美圣草素则为0.4、4、40 mg/L。将脂多糖(LPS)溶解于含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基当中，并配制成终浓度为6 mg/L。

1.4 细胞的分组和免疫刺激活性的检测

将传代后的RAW264.7细胞和DC2.4细胞分别接种于96孔板中，置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养12 h，待细胞贴壁稳定，处于旺盛生长期，细胞形态正常，融合度为60%～70%时，弃掉96孔板中原培养基。每孔细胞中分别加入上述配制好的不同浓度的4种中药单体，分别为蔓荆子黄素组、刺芒柄花素组、北美圣草素组和白杨素组，再根据浓度不同分为低、中、高3个亚组，同时每组药物再分别设置阴性对照亚组和阳性对照亚组；其中阴性对照亚组为每孔细胞中分别加入含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基100 μL，阳性对照亚组为每孔细胞中分别加入浓度为6 mg/L的LPS溶液100 μL。然后均置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中共同孵育48 h[11]以后，分别向RAW264.7细胞以及DC2.4细胞中加入PE anti-mouse CD80、PE anti-mouse CD86、PE anti-mouse MHCⅠ和PE anti-mouse I-A/I-E 4种抗体，在4 ℃无血清DMEM培养基中避光孵育30 min后，用Beckman CytoFLEX流式细胞仪检测2种细胞表面CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ的表达情况。每组细胞设置3个复孔，结果取均值。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 4种中药单体对RAW264.7细胞的免疫激活作用比较

两因素析因设计方差分析结果显示，药物、浓度以及药物与浓度交互作用均对RAW264.7细胞中CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ4种表面标志物的表达具有显著影响(F药物=19.44～168.97，F浓度=4.74～2 715.65，F药物*浓度=4.37～196.42，P<0.05)。单独效应分析结果显示，4种中药单体的高浓度亚组间RAW264.7细胞中4种表面标志物表达水平比较差异均有显著性(F=5.40～44.18，P<0.05)，低浓度和中浓度亚组间，4种表面标志物的表达水平比较差异均无显著性(P>0.05)。另外，白杨素组的各亚组间RAW264.7细胞之中CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ表达水平比较差异均有显著性(F=17.54～51.54，P<0.05)；蔓荆子黄素组和刺芒柄花素组的各亚组间RAW264.7细胞之中CD80、CD86、MHCⅠ表达水平比较差异有显著性(F=38.02～1 543.14，P<0.05)，但MHCⅡ的表达水平比较差异无显著性(P>0.05)；北美圣草素组的各亚组间RAW264.7细胞中CD80和CD86表达水平比较差异均具有显著性(F=331.91、1 543.14，P<0.05)，但MHCⅠ和MHCⅡ的表达水平比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。

表1 4种中药单体对RAW264.7细胞的免疫激活作用比较

2.2 4种中药单体对DC2.4细胞的免疫激活作用比较

析因设计方差分析结果显示，药物、浓度以及药物与浓度交互作用均对DC2.4细胞中CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ4种表面标志物表达有显著的影响(F药物=25.52～68.43，F浓度=37.62～300.95，F药物*浓度=15.26～77.89，P<0.05)。单独效应分析结果显示，4种中药单体的中、高浓度亚组间DC2.4细胞中4种表面标志物表达水平比较差异均有显著性(F=3.82～170.14，P<0.05)，低浓度亚组DC2.4细胞中CD80、CD86和MHCⅠ表达水平比较差异均有显著性(F=3.86～10.80，P<0.05)，但MHCⅡ的表达水平比较差异无显著性(P>0.05)。另外，白杨素组和北美圣草素组各亚组间DC2.4细胞中4种表面标志物表达水平比较差异均具有显著性(F=3.89～144.44，P<0.05)；蔓荆子黄素组和刺芒柄花素组的各亚组间DC2.4细胞中CD80、CD86、MHCⅡ表达水平比较差异有显著性(F=34.52～240.18，P<0.05)，但MHCⅠ的表达水平差异无显著性(P>0.05)。见表2。

表2 4种中药单体对DC2.4细胞的免疫激活作用比较

3 讨 论

疫苗佐剂是指掺入疫苗中以增强免疫原性的化合物，可提高高度纯化的疫苗抗原的免疫原性，增强疫苗的效力，且不影响疫苗安全性[12-13]。疫苗佐剂的作用方式包括抗原的缓释、免疫细胞的募集、炎症小体的激活、MHC分子增强抗原提呈以及免疫调节[14]。疫苗添加佐剂的优势在于可以节省疫苗剂量，并能更加快速、广泛和强力地诱导免疫反应[15]。目前为止，获得许可的人类疫苗中使用的佐剂和仅在实验室或临床试验中进行研究的佐剂都有引起全身或局部不良反应的可能，因此，疫苗佐剂的开发和研制具有重要的临床意义[16-20]。激活机体的先天性免疫机制，是目前研发更安全有效的新一代疫苗佐剂的新方向[21]。

研究显示，先天免疫在抗肿瘤等方面发挥着至关重要的作用。在肿瘤免疫防御和监测中，自然杀伤细胞作为先天免疫细胞可以充分发挥其细胞毒性作用直接杀伤肿瘤细胞，巨噬细胞的吞噬功能在针对某些肿瘤的免疫防御中也有一定作用。另外先天免疫细胞在抗体诱导后也可以发挥效应功能，例如依赖于Fc受体表达的抗体依赖性细胞毒作用。因此，先天免疫细胞在肿瘤进展中起着重要的防御和调节作用[22]。此外，针对抗肿瘤的有效免疫反应通常涉及先天免疫系统和适应性免疫系统细胞之间的相互协调[23]，如可通过APCs在肿瘤条件下激活肿瘤抗原特异性CD8+T细胞功能来实现[24]。APCs对肿瘤抗原的摄取导致交叉呈递——MHCⅠ分子呈递外源性抗原，从而诱导肿瘤特异性CD8+T细胞的启动和该细胞群体的增殖[25]。

中药提取物可通过不同途径作用于先天免疫和适应性免疫系统，其中黄芪多糖等这些传统补益类药物中的多糖，调节免疫功能的作用较为突出，可通过增加树突状细胞等APCs的数量，或促进其表面细胞因子的表达，加强抗原提呈能力，增强机体免疫[26-27]。黄酮类中药单体对机体的细胞免疫和体液免疫功能也具有调节作用，主要类型有二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄酮、黄酮醇、花色素、异黄酮等。

本研究通过探讨白杨素、蔓荆子黄素、刺芒柄花素和北美圣草素4种中药单体在体外对巨噬细胞和树突状细胞分子表达的调控，用流式细胞仪检测药物诱导先天免疫细胞活化的能力，筛选出对APCs免疫激活潜能最强的中药单体。结果显示，白杨素组的各亚组之间RAW264.7和DC2.4细胞表面的CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ表达水平比较差异均有显著性；蔓荆子黄素组和刺芒柄花素组的各亚组间RAW264.7细胞中CD80、CD86和MHCⅠ的表达水平比较差异有显著性，DC2.4细胞中CD80、CD86和MHCⅡ的表达水平比较差异有显著性；北美圣草素组的各亚组间RAW264.7细胞和DC2.4细胞中CD80和CD86的表达水平比较差异有显著性，DC2.4细胞的MHCⅠ和MHCⅡ表达水平比较差异有显著性。在低浓度的4种中药单体刺激下，各药物间DC2.4细胞中CD80、CD86和MHCⅠ表面标志物表达水平比较差异有显著性，RAW264.7细胞中4种表面标志物表达水平比较差异无显著意义；在中浓度的4种中药单体刺激下，各药物间DC2.4细胞中4种表面标志物表达水平比较差异有显著性，RAW264.7细胞中4种表面标志物表达水平比较差异无显著性；在高浓度的4种中药单体刺激下，各药物间RAW264.7和DC2.4细胞中CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ表达水平比较差异均有显著性，其中白杨素在高浓度时刺激RAW264.7和DC2.4细胞中4种表面标志物表达水平最高。由此可以提示，高浓度时4种中药单体均对RAW264.7和DC2.4细胞具有免疫激活作用，白杨素免疫的激活能力最强，蔓荆子黄素和刺芒柄花素次之，北美圣草素最弱。

研究显示，APCs摄取和加工抗原后，将抗原以抗原肽-MHCⅡ类分子复合物的形式表达在细胞膜上并提呈给CD4+T细胞。MHC分子由一组不同的多态基因编码[28]，MHC分子首先与T细胞受体相结合，然后将抗原呈递给T细胞受体，提供初始T细胞活化的启动信号(第一信号)，同时还能够以抗原肽-MHCⅠ类分子复合物的形式将抗原肽提呈给CD8+T细胞并将其激活。另外APCs高表达CD80、CD86等共刺激分子，从而为T细胞充分活化提供了第二信号[29]。APCs分泌的细胞因子进一步诱导活化T细胞增殖和分化，从而启动免疫应答。本研究中，白杨素在体外刺激RAW264.7和DC2.4细胞的MHCⅠ和MHCⅡ分子的表达水平升高，增强了初始T细胞活化的起始信号(第一信号)；同时刺激RAW264.7和DC2.4细胞表面的共刺激分子CD80和CD86表达水平的升高，增强了T细胞活化的第二信号。因此，白杨素具有激活先天免疫，进而启动适应性免疫以及发挥抗肿瘤作用的潜力。目前，开发疫苗佐剂的重点是，找到一种能够保证其安全性且定义明确的化合物，它们应具有激活先天免疫反应并且增强或改变疫苗诱导的免疫应答的能力[30-31]。研究结果显示，白杨素作为一种黄酮类化合物，其安全性较高，而且定义明确、结构简单[32-33]，体外激活APCs的能力也较强，具有做为疫苗佐剂的潜力，但后续还需要进一步的体内试验进行验证。

综上所述，白杨素对APCs具有免疫激活作用，其中高浓度的白杨素对APCs的免疫激活潜能最强，未来有望作为一种候选药物在抗肿瘤治疗和疫苗佐剂研发等领域发挥作用。