bHLH转录因子在植物抗非生物胁迫基因工程中的应用进展

李君霞 樊永强 代书桃 秦娜 宋迎辉 朱灿灿 王春义 翁鸿燕

摘要：植物在生长发育过程中，经常会遭遇干旱、高盐和低温等非生物胁迫的伤害，从而影响其生长发育和地理分布，对于作物而言会降低产量和品质，危害农业生产发展，因此植物抗逆育种研究已经成为保障农业生产的一个重要内容。利用基因工程技术提高植物的抗逆性是一条优于传统育种途径的快捷有效的途径。bHLH转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育及抵御多种非生物胁迫反应（干旱、高盐、低温、缺铁等）中具有重要的调控作用。有研究者发现，很多bHLH转录因子可以提高植物的抗逆性。本文全面系统阐述了植物bHLH转录因子的基本结构特征及其在植物抗旱、耐盐、耐冷、耐缺铁基因工程中的应用进展，以期为bHLH转录因子的利用及植物抗旱遗传改良和育种提供参考。

关键词：植物;bHLH转录因子;抗旱;耐盐;耐冷;耐缺铁;基因工程

中图分类号： S332.1;S188文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）12-0001-09

收稿日期：2021-08-06

基金项目：现代农业产业技术体系建设专项（编号：nycytx-CARS-06）;河南省农业科学院科技创新团队项目（编号：2021KJCXTD30）;河南省农业科学院基础性科研项目（编号：2021JCKY006）。

作者简介：李君霞（1973—），女，河南禹州人，硕士，副研究员，主要从事杂粮遗传育种及栽培研究。E-mail：lijunxia@126.com。

通信作者：翁鸿燕，高级农艺师，主要从事丘陵旱地作物研究。E-mail：77069205@qq.com。

植物在生长发育过程中，经常遭遇非生物胁迫（如干旱、高盐、低温等），从而影响其生长发育、地理分布，甚至降低产量、品质[1]。为了生存，植物在长期进化过程中逐渐建立了复杂的调节机制以应对环境胁迫[2]。一旦遭遇非生物胁迫，植物体内各种各样的基因被诱导表达以抵御胁迫伤害。这些基因主要分为2类：调节基因和功能基因，它们的功能主要包括胁迫信号转导、调控胁迫诱导基因表达和抗逆[1，3]。其中转录因子是重要调节基因，在胁迫响应过程中调控靶基因表达以抵御逆境胁迫。目前，在抵御非生物胁迫方面发挥重要作用的转录因子家族主要有MYB （v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）、AP2/ERF（APETALA2/ethylene response factor）、NAC [无顶端分生组织（no apical meristem，NAM）、拟南芥转录激活因子1（Arabidopsis transcription activation factor 1，ATAF1）、ATAF2、杯状子叶2（cup-shaped cotyledon 2，CUC2）]、碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper，bZIP）、WRKY、碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）家族等[4-9]。其中，bHLH家族是植物中较大的转录因子家族之一，家族成员众多，亚族非常丰富[10]。拟南芥（A. thaliana）中的bHLH家族成员有162个[11]，水稻（Oryza sativa）中的bHLH家族成员有167个，分为22个亚族，水稻、拟南芥中所有的bHLH转录因子分为25个亚族[12];辣椒（Capsicum annuum）中的bHLH家族成员有122个，分为21个亚族[13];黄瓜（Cucumis sativus）中的bHLH家族成员有142个，分为32个亚族[14];菜豆（Phaseolus vulgaris）中的bHLH家族成员有155个，分为21个亚族[15]。bHLH转录因子在植物生长发育及抵御干旱、高盐、低温等非生物胁迫方面具有重要调控作用[9]。本文全面系统阐述了植物bHLH转录因子结构及在植物抗旱、盐、冷、缺铁基因工程中的应用进展，以期为bHLH转录因子的利用及植物抗旱遗传改良和育种提供参考。

1 bHLH转录因子的基本结构特征

bHLH转录因子因含有高度保守的bHLH结构域而得名[16]。bHLH结构域由60个左右的氨基酸组成，包含2个功能不同的保守区域，分别是位于N末端的通常由13～17个氨基酸组成的碱性区、位于C末端的由近40个氨基酸组成的HLH区[17-19]。碱性区域是DNA结合域，能特异性识别靶基因启动子区中的E-box（5′-CANNTG-3′）[20]，E-box中间的2个核苷酸可变，最常见的是回文G-box （5′-CACGTG-3′）[12]。HLH区参与同源或异源二聚体的形成，通过碱性区与DNA结合，调控下游靶基因的表达[21]。

2 bHLH转录因子在植物抗非生物胁迫基因工程中的应用进展

bHLH转录因子家族成员众多，且不同成员对非生物胁迫逆境的反应程度不同，有的成员能够提高植物对干旱、高盐、低温、缺铁等单一环境胁迫的抗性，有的成员可以同时提高植物对2种及以上环境胁迫的抗性，甚至提高籽粒产量。

2.1 单一抗性

2.1.1 抗旱 拟南芥脱落酸（abscisic acid，ABA）诱导的bHLH转录因子编码基因（ABA-inducible bHLH-type transcription factor，AtAIB） 受ABA和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）誘导表达。敲除AtAIB基因的拟南芥植株对ABA的敏感性降低;超表达AtAIB基因的拟南芥植株对ABA的敏感性增强，且在土培干旱条件下，其存活率是野生型对照的2倍、敲除AtAIB基因植株的2.7倍，表现出一定的抗旱性[22]。由此可见，AtAIB可以调控ABA信号传递，进而提高转基因植株的抗旱性。AtbHLH68基因受干旱诱导表达，与野生型对照相比，超表达该基因的拟南芥植株生长缓慢且植株矮小，主根长显著变短且呈淡黄色，侧生根数显著减少，ABA含量显著增加;在干旱条件下，超表达AtbHLH68基因的植株绿叶率高，生长状态好，抗旱性提高。分析表达情况发现，超表达AtbHLH68基因的植株中ABA代谢基因[拟南芥醛氧化酶3基因（Arabidopsis aldehyde oxidase 3，AAO3）]、ABA相关的干旱胁迫响应基因 [v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因同源物2基因 （v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog 2，MYC2）、bHLH122基因、脱水响应29A基因 （responsive to dehydration 29A，RD29A）]的表达量显著提高，侧根发育基因[ABA敏感3基因（ABA insentive 3，ABI3）]的表达量显著降低[23]。说明AtbHLH68可以调控侧根伸长，并通过ABA依赖途径调控ABA信号传递，进而提高植物的抗旱性。

除了从模式植物拟南芥中分离获得可以提高植物抗旱性的bHLH基因外，研究者还陆续从胡杨（Populus euphratica）、苦荞麦（Fagopyrum tataricum）、苹果（Malus domestica）中分离获得可以提高植株抗旱性的bHLH基因。PebHLH35基因受干旱和ABA诱导表达，例如，在拟南芥中超表达胡杨PebHLH35基因后，在正常条件下，转基因植株主根长较空载体对照变长，且叶片增多、叶面积增加;在干旱条件下，超表达PebHLH35基因的植株萎蔫率较空载体对照降低55%，复水后存活率高达60%，而空载体对照全部死亡，表现出很强的抗旱性。进一步分析发现，超表达PebHLH35基因的植株气孔密度、气孔开度、蒸腾速率、失水率均显著降低，叶绿素含量和光合速率均显著提高，且气孔调控相关基因[磷脂酶C1（phospholipase C1，PLC1）]的表达量显著提高[24]。说明PebHLH35基因通过调控气孔密度、开度及光合作用来积极响应干旱胁迫。FtbHLH3基因主要受聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、ABA诱导表达。有研究发现，超表达苦荞麦FtbHLH3基因显著提高了拟南芥植株在干旱条件下的存活率，这主要归因于转基因植株中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、离子渗漏率、活性氧 （reactive oxygen species，ROS）（如H2O2、O-2·） 积累量减少，脯氨酸含量、抗氧化酶[过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）]活性、光合效率提高。表达分析结果显示，在干旱条件下，转基因植株中多个胁迫响应基因[单脱水抗坏血酸还原酶基因（monodehydroascorbate reductase，MDAR）、乙醛脱氢酶3家族H基因 （Aldehyde dehydrogenase 3 family，member H，ALDH3H）、MYC2基因、早期脱水响应4基因（early responsive to dehydration 4，ERD4）、CAT基因、SOD基因、九顺式环氧蛋白质双加氧酶基因 （nine-cis epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）、Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶 5基因（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthase，P5CS）]的表达量均较野生型对照显著提高，其中NCED是ABA合成的限速酶基因[25]，说明FtbHLH3通过ABA依赖途径提高了转基因植株的抗旱性。苹果MdbHLH130基因受脱水胁迫影响而强烈诱导表达，超表达MdbHLH130基因的苹果愈伤组织对PEG胁迫表现出很强的抗性，且超表达MdbHLH130基因的烟草（Nicotiana tabacum）植株在干旱条件下的发芽率、根长均显著增加，存活率较野生对照提高3.0～4.7倍。进一步分析发现，超表达MdbHLH130基因的烟草植株由ABA诱导的气孔关闭度、叶片失水率、电解质渗漏、MDA含量、ROS积累量均显著降低，抗氧化酶（CAT、POD、SOD）活性显著增加，而ROS清除基因（SOD、POD、CAT）和胁迫响应基因[脱水响应元件结合蛋白3基因（dehydration-responsive-element-binding protein，DREB3）、ERD10C基因、ERD10D基因、NCED1基因、晚期胚胎丰富蛋白5基因 （late-embryogenesis-abundant protein 5，LEA5）、脂转移蛋白1基因 （lipid-transfer protein 1，LTP1）]的表達量显著提高[26]。说明MdbHLH130可以通过调节气孔关闭和ROS清除来提高转基因植株的抗旱性。

2.1.2 耐盐 目前，关于bHLH基因仅仅响应植物高盐胁迫的报道较少。Zhou等从野生稻（Oryza rufipogon）中分离了OrbHLH2基因，发现在拟南芥中超表达该基因提高了转基因植株的耐盐性。在高盐条件下，超表达OrbHLH2基因植株的种子萌发率较野生型对照提高了54.5%～69.7%，且胁迫响应基因[C重复结合转录因子3基因 （C-repeat binding transcription factor 3，CBF3）、RD29A、冷调控15A基因 （cold regulated 15A，COR15A）、激酶1基因 （kinase 1，KIN1）]的表达量提高[27]。对野生型对照和超表达OrbHLH2基因的植株进行ABA处理后发现，两者在种子萌发和胁迫响应基因表达方面的表现均相似，说明OrbHLH2基因对盐胁迫的响应不依赖于ABA。Zheng等发现，bHLH转录因子家族多效唑抗性基因 （paclobutrazol resistances，PREs）在ABA处理下的表达量降低，在高盐胁迫条件下的表达量提高[28]。有研究发现，在拟南芥中超表达PREs基因提高了转基因植株的耐盐性，而pre6突变体的耐盐性与野生型对照相比无明显变化;超表达PREs基因的拟南芥植株对ABA的敏感性提供，而pre6突变体对ABA的敏感性降低，说明PREs在调控高盐胁迫方面是功能性冗余的。bHLH转录因子家族成员众多，功能也不尽相同，有的bHLH转录因子正调控植物的耐盐性，有的bHLH转录因子负调控植物的耐盐性。Verma发现，在拟南芥中超表达bHLH转录因子编码基因AtMYC2后，转基因植株对高盐胁迫的耐受性降低，脯氨酸含量与野生型对照相比无显著差异;而myc2突变体对高盐胁迫的耐受性增强，且脯氨酸含量显著增加[29]。进一步分析发现，在高盐条件下，myc2突变体中P5CS1基因表达量显著提高，在超表达MYC2基因植株中，P5CS1基因表达量无显著变化，这是因为MYC2转录因子可与P5CS1基因的5′非翻译区（UTR）结合，进而调控P5CS1基因的表达。综上，MYC2转录因子负调控P5CS1基因的表达，进而负调控脯氨酸的合成，可以通过沉默MYC2基因表达来提高植株的耐盐性。

2.1.3 耐冷 bHLH转录因子家族中响应低温胁迫的成员以CBF表达诱导因子 （inducer of CBF expression 1，ICE1）为主，ICE1是类似MYC的bHLH转录因子，直接结合并激活DREB1/CBF基因的表达，以调控低温响应。在拟南芥中超表达水稻OsICE1、OsICE2基因（与AtICE1序列高度相似）后，会提高转基因植株的耐冷性和冷响应基因（RD29A、COR15A、COR47）的表达量。进一步分析发现，OsICE1和OsICE2转录因子与冷适应关键转录因子OsMYBS3互作[30]，表明OsICE1、OsICE2转录因子通过调控冷响应基因的表达来调控植物的耐冷性。类似的，龙眼（Dimocarpus longan Lour.） DlICE1基因、茄子（Solanum melongena）SmICE1a基因均受冷胁迫诱导表达，在拟南芥中分别超表达这2个基因均会提高转基因植株的耐冷性，这主要得益于转基因植株的脯氨酸含量提高，离子渗漏量、MDA含量和ROS积累量降低，且一些ICE1-CBF冷信号途径基因（AtCBF1/2/3）、冷响应基因（AtRD29A、AtCOR15A、AtCOR47、AtKIN1）表达量显著提高[31-32]。另外，枸橘（Poncirus trifoliata）PtrICE1基因受冷、脱水、高盐诱导表达，尤其是冷条件;PtrICE1可与精氨酸脱氢酶（arginine decarboxylase，PtADC）互作。在烟草或者柠檬（Citrus limon）中超表达PtrICE1基因提高了转基因植株的耐冷、耐冻性。在低温胁迫条件下，超表达PtrICE1基因的植株ADC基因表达量、多胺含量、叶绿素含量及抗氧化酶SOD、CAT活性提高，离子渗漏、活性氧积累量降低[33]。说明PtrICE1转录因子通过与ADC基因结合来调控多胺水平，进而调控植物的耐冷性。

除了ICE1基因外，还有些bHLH基因也能提高植物的耐冷性。例如，PtrbHLH基因受多种非生物胁迫诱导表达，尤其是冷，可与POD基因的E-box元件结合。在烟草、柠檬、柚子（C. grandis）中分别超表达PtrbHLH基因后，均提高了转基因植株的耐冷性，通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术下调该基因在枸橘中的表达量发现，枸橘对冷的敏感性增强。与野生型对照相比，超表达PtrbHLH基因的植株离子渗漏量、MDA含量、ROS积累量降低，抗氧化酶（CAT、POD、SOD）活性及抗氧化酶（CAT、POD、SOD）编码基因表达量升高，RNAi植株相反。且外施POD抑制剂提高了超表达PtrbHLH基因植株的H2O2含量，降低了其耐冷性，外施POD抑制剂提高了RNAi植株的耐冷性[34-35]。由此可见，超表达PtrbHLH基因植株耐冷性的提高在一定程度上归因于其对ROS清除能力的提高。类似的，甜橙（C. sinensis）CsbHLH18基因也可与CsPOD基因启动子区特异性结合。在烟草中超表达CsbHLH18基因也提高了转基因植株的耐冷性。在冷胁迫条件下，与野生型对照相比，超表达CsbHLH18基因植株的ROS积累量降低，SOD、POD、CAT活性及SOD、POD、CAT基因表达水平提高。相反的，敲除bHLH18基因的植株对冷的敏感性增强，SOD、POD、CAT活性及SOD、POD、CAT基因表达水平降低，ROS积累量提高[36]。由此可见，CsbHLH18对植物耐冷性的提高在一定程度上是通过直接调控抗氧化基因的表达进而调控ROS平衡来实现的。另外，NtbHLH123基因受冷胁迫诱导，在烟草中超表达NtbHLH123基因后，在冷胁迫条件下，转基因植株的存活率为39.3%～59.6%，而野生型对照的存活率仅为10.0%。进一步分析发现，NtbHLH123转录因子与 NtCBF 基因启动子区的 G-box/E-box元件结合，直接正调控其表达;在冷胁迫条件下，与野生型对照相比，超表达NtbHLH123基因植株的离子渗漏量、MDA含量、ROS积累量降低，一些ROS清除基因（NtSOD、NtCAT、NtPOD）及其他胁迫响应基因（NtLEA5、NtERD10C、NtERD10D）的表达量提高[37]。由此可见，NtbHLH123转录因子通过调控NtCBF、ROS清除相关基因、胁迫响应基因来提高植物的耐冷性。

2.1.4 耐缺铁性 Zhang等发现，敲除AtbHLH104基因的拟南芥植株耐缺铁性大大降低，幼嫩叶片中的铁含量较野生型对照降低了15.5%，成熟叶片中铁含量没有差异;相反的，超表达AtbHLH104基因拟南芥植株耐缺铁性增强，幼嫩叶片、成熟叶片、花、籽粒中的铁含量均较野生型对照显著增加，同时铁蛋白1基因 （ferritin1，FER1）表达量提高[38]。进一步分析發现，AtbHLH104可与IVc亚组bHLH转录因子吲哚乙酸-亮氨酸抗性3（IAA-Leucine resistant 3，ILR3）互作，且超表达AtILR3基因的拟南芥植株耐缺铁性也增强。另外，AtbHLH104和AtILR3均可与铁胁迫响应调控基因Ib亚组bHLH基因和PYE（POPEYE）基因启动子区的E-Box元件结合，进而调控这2条转录调控途径。由此可见，AtbHLH104和AtILR3均可通过调控Ib亚组bHLH基因和AtPYE基因来调控植物的铁胁迫响应。

除了在模式植物拟南芥中发现提高植物耐缺铁性的bHLH基因外，研究者已经陆续从山杨（Populus tremula）、苹果、大豆（Glycine max）、水稻中也发现了提高植物耐缺铁性的bHLH基因。山杨FER 类铁缺乏诱导转录因子1基因 （FER-like iron deficiency-induced transcription factor 1，FIT）受缺铁胁迫诱导表达，超表达PtFIT基因提高了转基因山杨植株的耐缺铁性。在缺铁胁迫条件下，转基因植株叶绿素含量及叶绿素a/b较野生型对照显著提高[39]。苹果MdbHLH104受缺铁诱导表达，超表达MdbHLH104基因提高了缺铁条件下苹果植株质膜H+-ATPase活性和耐缺铁性，这是因为MdbHLH104转录因子可与MdAHA8（autoinhibited H+-ATPases 8）基因启动子区结合，调控其表达，进而调控缺铁条件下质膜H+-ATPase活性和铁吸收[40]。另外，同时超表达大豆GmbHLH57和GmbHLH300基因也提高了转基因植株的耐缺铁性，转基因植株中铁吸收基因[铁还原酶氧化酶基因（ferric reductase oxidase 2，FRO2）、铁调控转运基因（iron-regulated transporter，IRT1）]表达量和铁含量均提高[41]。众所周知，水稻OsHRZ1（haemerythrin motif-containing really interesting new gene （RING）-and zinc-finger protein 1）和 OsHRZ2转录因子负调控缺铁响应。Kobayashi等发现，OsbHLH058转录因子可与 OsHRZ1、OsHRZ2蛋白互作，超表达OsbHLH058基因水稻植株耐缺铁性增强，且缺铁条件下转基因植株种子中铁含量升高，缺铁诱导基因[烟酰胺合成酶1基因（niacinamide synthetase 1，NAS1）、麦根酸家族植物铁载体转运1基因 （transporter of mugineic acid family phytosiderophores 1，TOM1） 、类黄色条纹蛋白15基因（yellow stripe-like protein 15，YSL15）]、OsIRT1的表达量提高[42]。相反的，敲除OsbHLH058基因的水稻植株对缺铁敏感性增强，铁诱导基因的表达量降低[42]，说明OsbHLH058转录因子正调控缺铁响应，在一定程度上受到OsHRZ控制。

2.2 复合抗性

2.2.1 抗旱+耐盐 拟南芥AtbHLH92基因受盐、脱水、甘露醇、冷诱导表达。超表达AtbHLH92基因增加了转基因拟南芥植株的根长、侧根数，促进了转基因植株的生长，提高了胁迫响应基因[COR47、Ⅲ类过氧化物酶10基因（class Ⅲ peroxidases，PER10）、PER52基因、PER59基因]的表达量，增强了转基因植株的耐盐性、抗旱性，而Atbhlh92突变体对高盐、干旱的敏感性增强[43]。类似的，AtbHLH112基因受干旱、高盐、ABA诱导表达，AtbHLH112转录因子可与胁迫响应基因启动子区的E-box元件、GCG元件结合，超表达该基因提高了拟南芥植株的抗旱性和耐盐性，反之，沉默该基因增强了转基因拟南芥植株对干旱、高盐的敏感性。与野生型对照相比，超表达AtbHLH112基因提高了转基因植株中P5CS基因的表达量，降低了Δ1-吡咯啉-5羧酸盐脱氢酶基因（Δ1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase，P5CDH）和脯氨酸脱氢酶基因（proline dehydrogenase，ProDH）的表达量，进而提高了转基因植株的脯氨酸含量;同时，超表达AtbHLH112基因提高了转基因植株POD、SOD基因表达量及POD、SOD活性，最终提高了转基因植株对ROS的清除能力[44]。由此可见，AtbHLH112转录因子通过与E-box元件、GCG元件结合来调控基因的表达，进而调控脯氨酸合成和ROS清除，最终调控植物的抗逆性。

除了在模式植物拟南芥中发现能够同时提高植物抗旱、耐盐性的bHLH基因外，研究者还从刚毛柽柳（Tamarix hispida）、金鱼草（Antirrhinum majus）、密罗木（Myrothamnus flabellifolia）、龙爪稷（Eleusine coracana L.）中发现了可以同时提高植物抗旱性、耐盐性的bHLH基因。例如，刚毛柽柳ThbHLH1基因受高盐、ABA、甘露醇诱导表达，与G-box特异性结合以响应高盐、甘露醇胁迫，在拟南芥中超表达该基因提高了转基因植株的耐盐性和抗旱性。与野生型对照相比，在高盐和干旱条件下，转基因植株中的甜菜碱、脯氨酸含量与Ca2+浓度、POD活性、SOD活性均提高，MDA含量、ROS积累量及细胞死亡率降低。究其原因，ThbHLH1转录因子调控P5CS基因、甜菜碱醛脱氢酶基因（betaine-aldehyde dehydrogenase，BADH）、POD基因、SOD基因、LEA基因、热激蛋白基因（heat shock protein，HSP）等抗逆基因的表达[45]。由此可见，ThbHLH1转录因子通过调控抗逆相关基因的表达来提高转基因植株的渗透压、ROS清除能力，进而提高转基因植株的耐盐性和抗旱性。另外，超表达金鱼草bHLH转录因子编码基因AmDEL（Delila）提高了转基因拟南芥植株类黄酮积累量及抗旱、耐盐性。与野生型对照相比，在干旱和高盐条件下，超表达AmDEL基因显著增加了转基因植株脯氨酸含量、相对含水量，降低了MDA、H2O2含量，且提高了类黄酮合成基因[苯丙基氨酸解氨酶基因 （phenylalanine ammonialyase，PAL）、查尔酮合成酶基因（chalcone synthase，CHS）、查尔酮异构酶基因（chalcone isomerase，CHI）、黄烷酮-3-羟化酶基因（flavanone-3-hydroxylase，F3H）、 黄酮醇合成酶基因（flavonol synthase，FLS）、黄烷酮醇还原酶基因（dihydroflavonol reductase，DFR）]、P5CS基因、ROS清除基因（SOD、POD）的表达量，提高了PAL、CHI、DFR、P5CS、SOD、POD活性[46-47]。说明AmDEL基因通过调控类黄酮合成基因、抗氧化酶基因的表达来调控植株的抗逆性。此外，密罗木 bHLH家族成员光敏色素互作因子1基因（phytochrome-interacting factor 1，PIF1）和MfbHLH38基因均受脱水诱导表达，在拟南芥中分别超表达这2个基因后，均提高了转基因植株的抗旱性和耐盐性，这主要归因于转基因植株叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量和抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性的提高以及叶片失水率、MDA含量、ROS积累量的降低。另外，超表达MfPIF1 基因降低了干旱和高盐胁迫条件下转基因植株的气孔开度，提高了ABA含量及ABA合成与响应基因（NCED3、P5CS、RD29A）的表达量[48-49]。由此可见，MfPIF1和MfbHLH38转录因子通过提高植物保水、渗透调节能力，降低了胁迫诱导的氧化伤害，通过参与依赖于ABA的胁迫响应途径来提高植株的抗旱性和耐盐性。

有些bHLH基因不仅能提高植物的抗逆性，还能提高产量，这些bHLH基因在作物抗逆遗传改良中具有更重要的作用。例如，龙爪稷EcbHLH57基因受ABA、高盐、干旱诱导表达，超表达该基因促进了烟草植株根系发育（根长显著变长），提高了转基因植株的耐盐性和抗旱性。在干旱条件下，超表达EcbHLH57基因提高了转基因植株的光合速率和气孔导度，进而增加了生物量;在长期高盐胁迫条件下，超表达EcbHLH57基因提高了转基因植株单果荚种子质量和果荚数。通过对表达情况进行分析发现，超表达cbHLH57基因提高了转基因植株中胁迫相关基因[LEA14基因、rd29A基因、rd29B基因、SOD基因、APX基因、乙醛脱氢酶基因（alcohol dehydrogenase 1，ADH1）、HSP70基因 、磷酸酶2C基因（phosphatases 2C，PP2C）]的表达量，进而提高了LE转基因植株的抗逆性[50]。

2.2.2 耐盐+耐冷 野生稻OrbHLH001基因是类ICE1基因，受高盐诱导表达，在拟南芥中超表达该基因提高了转基因植株的耐盐性和耐冷性。与野生型对照相比，转基因植株中冷胁迫诱导基因（ICE1、 CBF1、CBF2、CBF3、RD29A、COR47）的表达量无差异[51]，说明OrbHLH001基因与ICE1基因有所不同，不依赖于CBF/DREB1冷响应途径。类似的，番茄（Solanum lycopersicum） SlICE1a基因受冷、高盐诱导表达，在烟草中超表达SlICE1a基因提高了转基因植株的耐冷性和耐盐性。与野生型对照相比，转基因植株的脯氨酸、可溶性糖、LEA含量增加，离子渗漏、MDA含量降低，胁迫响应基因（NtDREB2、NtERD10B、NtERD10C、NtERD10D、NtLEA5、NtP5CS）的表達量提高[52]，说明SlICE1a转录因子通过上调胁迫响应基因的表达量来提高植物的耐冷性和耐盐性。

2.2.3 抗旱+耐盐+耐冷 有些bHLH基因可以同时提高植物的抗旱性、耐盐性、耐冷性，甚至提高产量。例如，小麦TabHLH39基因受干旱、高盐、冷诱导表达，在拟南芥中超表达该基因提高了转基因植株的抗旱性、耐盐性与耐冷性。与野生型对照相比，超表达TabHLH39基因植株在干旱、高盐、冷胁迫条件下的存活率提高，可溶性糖、脯氨酸含量增加，离子渗漏降低，且胁迫响应基因[渗透响应高表达1基因（high expression of osmotically responsive 1，HOS1）、DRIP2、ERD6、AtICE1、RD29A、RD22、ERD1]的表达量提高[53]。结缕草（Zoysia japonica）ZjICE2基因也受冷、高盐、干旱诱导表达，可与ZjDREB1基因启动子区的MYC顺式元件结合，超表达该基因提高了转基因拟南芥、结缕草植株耐冷、抗旱、耐盐性。与野生型对照相比，在冷胁迫下，转基因植株的抗氧化酶（POD、SOD）活性和脯氨酸含量提高，MDA含量降低，冷胁迫响应基因（CBF1、CBF2、CBF3、COR47A、KIN1、RD29A）表达量提高;在干旱条件下，转基因植株叶绿素含量提高，气孔开度和MDA含量降低;在盐胁迫条件下，转基因植株叶面积指数和叶绿素含量提高[54]。类似的，超表达油菜（Brassica campestris）BcICE1基因也可提高烟草植株的耐冷性、耐盐性与抗旱性。在冷、高盐、干旱条件下，转基因植株的SOD、CAT、POD、APX活性及脯氨酸、可溶性糖、叶绿素含量增加，相对电导率和MDA含量降低，抗氧化酶基因（NtSOD、NtCAT、NtPOD）及胁迫响应基因（NtCBF1、NtCBF3、NtDREB2B、NtERD10B、NtERD10C）的表达量提高[55]。另外，超表达菊花（Chrysanthemum dichrum）CdICE1基因也提高了菊花植株的耐冷性、抗旱性、耐盐性，与野生型对照相比，超表达CdICE1基因植株在冷、干旱、高盐条件下的存活率分别提高了69.6%、123.3%、56.7%;CgDREBa、CgDREBb基因表达量提高，SOD、POD活性及脯氨酸含量增加[56]。

值得注意的是，在水稻中超表达AtICE1基因不仅提高了转基因植株耐冷、抗旱、耐盐性，还提高了水稻产量。在冷、高盐、干旱条件下，转基因植株小穗育性增强，籽粒产量分别较野生型对照显著提高了58%～214%、110%～220%、44%～66%。与野生型对照相比，在冷胁迫条件下，转基因植株的MDA、H2O2含量降低，膜稳定性增强，胁迫响应基因[OsDREB1A、OsMYB3R2、OsTPP1（trehalose-6-phosphate phosphatase ）]的表达量提高。在干旱胁迫条件下，转基因植株光合速率、气孔导度、水分利用效率提高，说明AtICE1通过提高胁迫响应基因的表达量、ROS清除能力、膜稳定性、水分利用效率等来提高植物的抗逆性[57]。

2.2.4 其他 bHLH基因除了可以综合提高植物的抗旱、耐盐、耐冷性，还可以综合提高植物的抗旱性、耐盐性、耐缺磷性与耐缺氮性。玉米（Zea mays）bHLH家族磷饥饿诱导转录因子1（Pi starvation induced transcription factor 1，PTF1）受低磷、ABA、PEG诱导表达，尤其在根部。Li等首先发现，超表达ZmPTF1基因可以提高转玉米植株的耐缺磷性。表型表现为转基因植株根系发育健壮，籽粒变大，穗长、行粒数、籽粒百粒质量增加[58]。与野生型对照相比，转基因植株根系可溶性糖含量提高，叶片可溶性糖含量降低，参与蔗糖合成的果糖-1，6-二磷酸酶、蔗糖磷酸合成（SPS1）基因表达量在叶片中提高，在根系中降低;参与蔗糖分解代谢的蔗糖转化酶基因表达量在根中降低。后来，Li等进一步研究发现，超表达ZmPTF1基因还可以提高玉米植株的抗旱性，表型表现为转基因玉米植株根数、根长增加，尤其是侧根，更值得注意的是，籽粒产量较野生型对照提高了147%。这在一定程度上是因为ZmPTF1转录因子可与NCED、CBF4、ATAF2/NAC081、NAC30基因启动子区的G-box元件结合，并且正调控这些基因的表达[59]。其中，NCED基因是ABA合成限速酶基因，ZmPTF1转录因子通过上调NCED基因表达量来促进ABA合成，激活ABA信号通路，转基因植株中依赖于ABA的胁迫响应被激活。综上，ZmPTF1转录因子通过促进根系发育、ABA积累与激活ABA、CBF4、ATAF2/NAC081、NAC30介导的胁迫响应来提高转基因植株的抗逆性。

TabHLH1基因受干旱、高盐、缺磷、缺氮胁迫诱导表达。Yang等首先发现，在烟草中超表达TabHLH1基因可以提高转基因植株的抗旱性和耐盐性[60]。在干旱、高盐条件下，与野生型对照相比，转基因植株的生物量增加，叶片失水率降低，气孔关闭快，脯氨酸和可溶性糖含量提高，H2O2含量减少，且转基因植株中ABA受体类吡喃巴丁抗性12基因（Pyrabatin riesistance like 12，PYL12）及蔗糖非发酵相关蛋白激酶2（sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2，SnRK2）家族应急激活蛋白激酶2;1基因（stress-activated protein kinase 2;1，SAPK2;1）的表达量提高。超表达NtPYL12、NtSAPK2;1基因促进了干旱和高盐胁迫条件下转基因植株气孔关闭，降低了叶片失水率，进而促进了转基因植株生长。在缺磷、缺氮条件下，与野生型对照相比，转基因植株株型大，生物量及磷、氮浓度增加，磷酸盐转运1基因（phosphate transporter 1，PT1）、硝酸盐转运2.2基因（nitrate transporter 2.2，NRT2.2）的表达量提高。另外，转基因植株的ROS积累量降低，抗氧化酶（SOD、CAT、POD）活性及NtSOD1、NtCAT1、NtPOD1;6基因的表達量提高[61]。综上，TabHLH1通过ABA依赖途径调控植物的抗旱性和耐盐性，通过调控磷酸盐转运蛋白基因、硝酸盐转运蛋白基因、抗氧化酶基因来调控植物的耐缺磷性和耐缺氮性。

3 展望

植物在生長发育过程中经常遭遇非生物胁迫危害，其中干旱、高盐、低温是主要的非生物胁迫，会严重影响植物生长、地理分布，甚至是作物产量和品质。因此，提高植物的抗旱性、耐盐性、耐冷性对农业生产意义重大。然而，植物的抗逆性状是复杂的数量性状，受多基因控制，易受环境影响，因此通过常规育种技术有效选育抗逆品种较难。基因工程技术是培育抗逆品种的有效途径，相比传统的常规育种，基因工程育种有其独特的优势，不仅基因来源广泛，而且能够实现对特定性状精确高效的改良，有广阔的应用前景。bHLH家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物抵御干旱、高盐、低温、缺铁胁迫反应中具有重要的调控作用。目前，bHLH转录因子在拟南芥、烟草及水稻、玉米、大豆等植物抗逆基因工程中的应用取得了一定的进展，研究者已经成功获得了一些转基因抗逆材料和抗逆候选bHLH基因，尤其是可以提高籽粒产量的bHLH基因，例如提高烟草种子产量的EcbHLH57基因、提高水稻籽粒产量的AtICE1基因，为作物抗逆遗传改良及育种奠定了坚实的基础。但是该领域目前还存在一些问题亟须解决：第一，转基因植物的抗逆性大部分是在室内、苗期鉴定的，但是室内模拟环境与大田环境不同，大田环境受影响的因素较多，另外，苗期抗逆生殖生长期不一定抗逆，因此应在大田、生殖生长期进行二次抗逆性鉴定。第二，抗逆性是复杂的多基因控制的数量性状，一般转单个抗逆基因植株的抗逆性提高幅度有限，甚至不能提高抗逆性，因此应加速多基因（尤其是调节基因）共同导入植物的系统研究，以提高转基因植物的抗逆性。第三，转基因植株中大多数bHLH基因是组成型超表达的，在提高转基因植株抗逆性的同时可能会造成生长缓慢、开花推迟等，故建议对bHLH基因进行胁迫诱导超表达，在提高转基因植株抗逆性的同时也不会影响生长发育。

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