结直肠癌组织中CISD2的表达及其对5-氟尿嘧啶化疗敏感性的影响

曹会茹，徐阳，王华德，文普帅，2

（锦州医科大学 1.基础医学院病理生理学教研室；2.生物人类学研究所，辽宁 锦州 121001）

研究［1］显示，我国结直肠癌发病率及死亡率均较高。目前，结直肠癌广泛使用的治疗方法是5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）及以5-FU为基础的联合化疗，但5-FU耐药性限制了其在临床中的应用［2］。因此，降低5-FU耐药性，提高肿瘤对5-FU的敏感性是提高化疗疗效、改善结直肠癌的预后关键。CDGSH铁硫结构域2（CDGSH iron-sulfur domain 2，CISD2）是CDGSH铁硫结构域蛋白家族成员，具有调控线粒体完整性和功能、钙代谢、氧化还原反应等作用［3］。研究证明，CISD2能增强乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力［4］；前列腺癌中高表达的CISD2能促进细胞的侵袭和迁移，并预示预后不良［5］；胃癌中CISD2增强癌细胞对5-FU的化疗敏感性［6］。目前，关于CISD2对结直肠癌的作用及临床意义研究未见报道。本研究探讨结直肠癌组织中CISD2的表达，分析其表达水平与临床指标的关系；同时探讨CISD2表达对5-FU敏感性的影响及分子机制，旨在为改善5-FU治疗结直肠癌的效果提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 组织细胞和主要试剂

选取锦州医科大学附属第一医院普外科手术切除25例患者的新鲜结直肠癌与癌旁组织，癌旁组织为癌组织边缘 ＞2 cm组织，于-80 ℃冰箱保存。纳入标准：术前未接受过放疗、化疗，经病理诊断为结直肠癌。本研究经锦州医科大学附属第一医院伦理委员会批准（批号：201923），患者家属知情同意。50例人结直肠癌组织微阵列由上海芯超生物技术有限公司完成。抗CISD2、caspase-3和β-actin抗体购自美国Proteintech公司；抗ATG5、Beclin 1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、AKT和p-AKT抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；反转试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自加拿大Applied Biological Materials公司。

1.2 方法

1.2.1 Oncomine数据库CISD2mRNA水平分析：分析Oncomine平台（http：//www.oncomine.org）结直肠癌和匹配的正常组织中CISD2mRNA的表达水平，筛选标准为P＜ 0.05。

1.2.2 细胞培养和转染：HCT116和HCT8肿瘤细胞株分别用含有10%的胎牛血清的McCoy 5A和L-15培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞，按Lipofectamine 3000转染试剂盒方法转染。

1.2.3 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）：TRIzol试剂提取组织中的RNA，采用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA，以cDNA为模板，采用荧光定量PCR试剂盒和ABI 7500实时PCR系统进行定量PCR反应，重复实验3次，以18S rRNA为内参；CISD2，正向引物5’-CACCGAGTCGTAGTCGAG GT-3’，反向引物5’-TTTCGGGTAGTGGAAAACC A-3’；18S rRNA，正向引物5’-GTAACCCGTTGAAC CCCATT -3’，反向引物5’-CCATCCAATCGGTAGTA GCG-3’。CISD2的表达水平采用2-ΔΔCt法进行计算。

1.2.4 免疫组化检测：人结直肠癌组织芯片经烘蜡、脱蜡、抗原修复、一抗孵育、封闭、二抗孵育、染色后，每个切片随机选择5个视野，Image J软件评估各视野CISD2平均光密度（average optical density，AOD）来判定CISD2的表达水平，AOD=积分光密度/面积。各视野下的染色强度及阳性细胞百分比评价：0分，无着色；1分，浅黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。阳性细胞0～5%，0分；6%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；76%～100%，4分。染色强度及阳性细胞百分比评分之和记为总分，0～2分为CISD2阴性表达，3～7为CISD2阳性表达。

1.2.5 MTT法检测细胞活力：将细胞分为对照组（转染空载质粒）、过表达CISD2组（转染CISD2表达质粒）、单纯5-FU处理组（10 μmol/L或20 μmol/L 5-FU处理24 h）、过表达CISD2和5-FU联合组（转染CISD2表达质粒，同时给予10 μmol/L或20 μmol/L 5-FU处理24 h）。取各组5×103个细胞悬液接种于96孔板，加入20 μL MTT试剂后，置于37 ℃培养箱中4 h，测定波长570 nm的吸光度（optical density，OD）值。

1.2.6 Western blotting检测：取对照组、过表达CISD2组、单纯5-FU处理组、过表达CISD2和5-FU联合组的蛋白样品经电泳分离，转膜、封闭，4 ℃孵育β-actin、CISD2、ATG5、Beclin 1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、AKT和p-AKT一抗，过夜，次日洗膜、二抗孵育、ECL显色、利用Image J软件分析各组条带灰度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0 软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以表示，2组比较采用t检验分析，计数资料采用率（%）表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织及癌旁组织中CISD2的表达及其与临床病理特征的关系

qRT-PCR结果显示，结直肠癌组织中CISD2mRNA表达水平为0.03±0.06，明显低于癌旁组织（1.02±0.32，P＜ 0.000 1，图1A）。Oncomine数据库多个结直肠数据集样本中CISD2mRNA水平也明显降低（图1B）。

免疫组化染色结果显示，CISD2主要定位于细胞质中。与癌旁组织（0.39±0.06）比较，CRC组织（0.35±0.04）CISD2表达显著减少（P＜ 0.01），见图1C、1D。

图1 结直肠癌组织及癌旁组织中CISD2的表达Fig.1 CISD2 expression in colorectal cancer（CRC）tissues and adjacent non-cancer tissues

2.2 结直肠癌组织中CISD2表达及其与患者临床指标的关系

结果显示，CISD2的表达阳性率与M期（P=0.03）相关，而与性别、年龄、TNM分期、T期、N期和淋巴结总数不相关，见表1。

表1 结直肠癌中CISD2的表达与各临床指标的关系Tab.1 Relationships between CISD2 expression in colorectal cancer tissue and clinical indices

2.3 CISD2的表达对结直肠癌细胞5-FU敏感性的影响

MTT实验结果显示，10、20 μmol/L5-FU处理HCT8细胞后，细胞活力分别为0.19±0.02和0.17±0.03，与对照组（0.33±0.02）比较，CRC细胞活力下降（t=10.50，P＜ 0.000 1；t=9.45，P＜ 0.000 1；图2A）；CISD2过表达联合5-FU（10、20 μmol/L）作用细胞时，细胞活力分别为0.16±0.01和0.12±0.01，显著低于单纯5-FU处理组细胞活力（t=3.58，P＜ 0.01；t=7.04，P＜0.000 1），见图2A。HCT116细胞中的实验结果与HCT8细胞类似，见图2B。

图2 过表达CISD2对结直肠癌细胞5-FU敏感性的影响Fig.2 Effect of overexpression of CISD2 on the sensitivity of colorectal cancer cells to 5-FU

2.4 5-FU对结直肠癌细胞CISD2表达的影响

Western blotting结果显示，在HCT8和HCT116细胞中，与对照组比较，5、10、20 μmol/L 5-FU处理24 h后CISD2蛋白水平显著升高，差异均有统计学意义（均P＜ 0.05），见图3、表2。

表2 5-FU对结直肠癌细胞中CISD2表达的影响Tab.2 Effect of 5-FU on CISD2 expression in colorectal cancer cells

图3 5-FU诱导结直肠癌细胞中CISD2的表达Fig.3 Effects of 5-FU treatment on expression of CISD2 in colorectal cancer cells

2.5 CISD2对结直肠癌细胞ATG5、Beclin 1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、caspase-3、活化caspase-3、AKT和p-AKT表达水平的影响

结果显示，与对照组HCT8和HCT116细胞比较，单纯5-FU处理组细胞中自噬蛋白Beclin 1、ATG5和LC3-Ⅱ/Ⅰ显著增高。与单纯5-FU处理组HCT8和HCT116细胞相比，过表达CISD2联合5-FU处理组细胞中Beclin 1、ATG5和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平降低而凋亡蛋白活化的caspase-3表达水平明显增高。与对照组HCT8和HCT116细胞相比，单纯5-FU处理组细胞中p-AKT表达水平降低；而与单纯5-FU处理组相比，过表达CISD2联合5-FU处理组细胞中p-AKT表达升高，见图4，表3、4。

表3 CISD2对5-FU诱导HCT8细胞自噬、凋亡相关蛋白的影响Tab.3 Effects of CISD2 on 5-FU-induced autophagy and apoptosis-related proteins in HCT8 cells

图4 CISD2对5-FU诱导结直肠癌细胞自噬和凋亡相关蛋白的影响Fig.4 Effect of CISD2 on 5-FU-induced autophagy and apoptosis-related proteins in colorectal cancer cells

3 讨论

CISD2与多种肿瘤的发生与演进密切相关。CISD2能激活Wnt/β-catenin信号通路促进胰腺癌细胞增殖［7］；CISD2缺失能抑制神经母细胞瘤细胞增殖和分化；WANG等 ［8］发现胃癌中CISD2表达水平增高，并调控AKT途径促进癌细胞增殖，这些研究提示CISD2在肿瘤中扮演癌基因的作用。但也有研究结果与之相悖，SUN等［6］发现胃癌中CISD2的表达水平显著下调，并能增强胃癌细胞对5-FU的敏感性。由此可见，CISD2在肿瘤中的角色仍有争议。本研究发现，CISD2在结直肠癌组织中表达显著下调，与结直肠癌患者的M分期有关。同时，CISD2可能通过AKT通路抑制自噬而增强结直肠癌细胞对5-FU的敏感性。

表4 CISD2对5-FU诱导HCT116细胞自噬、凋亡相关蛋白的影响Tab.4 Effects of CISD2 on 5-FU-induced autophagy and apoptosis-related proteins in HCT116 cells

当前，5-FU仍然是结直肠癌治疗不可或缺的药物。自5-FU广泛用于Ⅰ期结直肠癌治疗后，5-FU/亚叶酸治疗方案已成为结直肠癌标准治疗方案［9］。但是，5-FU的耐药性也成为治疗失败的主要原因。细胞自噬是真核生物中进化保守的、对细胞内物质进行周转利用的重要过程［10］。研究［11］表明，癌细胞可依赖自噬来进行细胞保护以应对不利的微环境，如营养缺乏、缺氧、缺乏生长因子、存在化疗或某些靶向疗法介导的耐药性等。因此，自噬抑制剂联合5-FU治疗在癌症治疗中展现出巨大潜力。5-FU联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤显著提高5-FU在肺癌和结直肠癌的治疗效果［9，12］。本研究发现，5-FU处理结直肠癌细胞时，自噬相关蛋白ATG5、Beclin 1和LC3-Ⅱ/Ⅰ水平增高，提示5-FU引起了结直肠癌细胞的自噬，而过表达CISD2显著抑制了5-FU诱导的结直肠癌细胞中的自噬过程，这也与胃癌中CISD2的作用一致［6］。因此，CISD2可作为潜在的干预靶点来解决5-FU耐药性问题。

研究［13］发现，PI3K/Akt/mTOR信号通路是抑制自噬的主要途径。外界信号刺激诱导PI3K调节亚基p85的SH2结构域磷酸化，催化亚基p110解除抑制而激活PI3K，而引起AKT第308位点苏氨酸和473位点丝氨酸磷酸化，活化后的AKT 激活mTOR而抑制自噬［14］。研究显示，PI3K/AKT/mTOR途径调控细胞自噬而影响肿瘤对5-FU药物的敏感性。TSPAN9下调PI3K/AKT/mTOR途径激活自噬而降低胃癌细胞对5-FU的敏感性［15］；辣椒素显著增加胆管癌细胞对5-FU敏感性，其机制是辣椒素激活PI3K/AKT/mTOR途径而抑制5-FU激活的自噬［16］；胃癌细胞中CISD2也经PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制5-FU诱导的自噬而增强癌细胞对5-FU的敏感性［6］。本研究中CISD2逆转了5-FU下调AKT磷酸化的作用，并抑制5-FU诱导的结直肠癌细胞自噬过程，提示CISD2可能经PI3K/AKT/mTOR途径抑制自噬而增强结直肠癌细胞对5-FU的敏感性。

综上所述，本研究发现CISD2在结直肠癌组织中表达下调，其过表达能增强结直肠癌对5-FU的敏感性，此作用可能是通过激活AKT/mTOR通路抑制自噬而实现的。靶向CISD2可能增加结直肠癌组织对5-FU的化疗敏感性，同时也可能是解决5-FU耐药问题的潜在方向。