FGF21、p53/MDM2及β-arrestin1表达在孕早期稽留流产意义

王秀华 孙红梅 黄玲玲*

1.山东省东营市东营区人民医院(257000)；2.内蒙古包钢医院

稽留流产(MA)是一种发生在妊娠早期的自发性流产[1]。通常发生突然，缺乏可靠的临床表型[2]。寻找识别MA发生风险的临床指标，以便早期干预。研究表明，成纤维细胞生长因子21(FGF21)可通过调节微量元素含量和代谢稳态参与妊娠期内分泌调节[3]；还可通过调节胎盘发育和血管形成，在维持妊娠方面起重要作用。在人类妊娠过程中，FGF21血清水平不断升高[4]；同时，人类胎盘中葡萄糖转运基因的增加与FGF21表达呈正相关[5]。在调节胎盘中葡萄糖代谢方面有潜在作用，妊娠期糖尿病和妊娠期高血压患者中异常升高已被证实[6]，但与MA的发生关系仍未知。细胞凋亡对正常妊娠的发展至关重要[7]。妊娠期间，多种基因共同协同调节细胞凋亡和增殖，其中p53基因已被证明在妊娠早期胎盘中表达，表达增强可诱导MDM2基因表达[8]。MDM2提高可导致健康细胞中p53降解，从而减弱后者介导的DNA损伤反应。p53和MDM2间相互作用，即p53/MDM2调节反馈回路，在诱导细胞周期G1期停滞或响应DNA损伤的细胞凋亡中起重要作用[9]。β-arrestin1在介导同源脱敏和内化过程中起重要调节作用[10]；通过信号转导机制介导细胞的发育和分化，并调控p53/MDM2、丝裂原活化蛋白激酶、NF-κB和PI3K/Akt信号通路[11-13]。最近研究表明，p53/MDM2介导的胰岛素样生长因子-1R泛素化可能与G蛋白偶联受体激酶/β-arrestin1系统密切相关。然而，关于β-arrestin1在稽留流产中的功能作用鲜见报道。基于现有研究，我们推测β-arrestin1可能是参与稽留流产的重要因子。本研究拟通过检测稽留流产患者血清FGF21、p53、MDM2及β-arrestin1表达，分析与孕早期稽留流产发生的可能关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月-2019年8月本院就诊的首次妊娠稽留流产患者(MA组)及意外妊娠行人工流产健康对照者(对照组)各53例。排除染色体异常(羊水G带染色体分析)、自身免疫性疾病、激素治疗、生殖器感染、习惯性流产或任何其他系统性疾病的患者。纳入标准：经超声检查确认为妊娠1～3个月无任何胎心活动的完整孕囊(末次月经后6周)或宫内妊娠最大直径≥10 mm但无卵黄囊，胎龄≥6周的空胎囊[14]。本研究获得本院伦理委员会的批准，纳入者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

对比两组出血时间、出血量、月经复潮时间及子宫内膜厚度。将获取的绒毛组织标本0.9%氯化钠溶液冲洗，采用RNA提取试剂盒(北京天根)提取样本总RNA并转录为cDNA，紫外分光光度法(E260/280，比值1.6～1.8)分析样本DNA含量和纯度，并用10 ng DNA行聚合酶链反应扩增。使用SYBR-GREEN聚合酶链反应主混合物和StepOne PlusTM实时聚合酶链反应系统进行定量聚合酶链反应。β-arrestin1及FGF21的相对表达以GAPDH为内源性对照。各基因引物序列如下：β-arrestin1为5’-CGACAAAGGGACCCGAGTG-3’及 5’-GCAGGTCAGCGTCACATAGA-3’；FGF21为5’-AAGACATCCAGGTTCCTGTG-3’及5’-CCTCAGGGTCAAAGTGGAG-3’；GAPDH为5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’及5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。取两组绒毛样本，Western Blot法检测绒毛膜组织中p53/MDM2。裂解液裂解组织，BCA蛋白分析试剂盒(Thermo Science，USA)测定样品浓度。10%SDS-PAGE行蛋白电泳，转移到PVDF膜。用5%脱脂牛奶封闭细胞膜，分别孵育p53抗体(Abcam，1：1000)、MDM2抗体(Abcam，1：500)及GAPDH抗体(Abcam，1：5000)。TBST洗涤，辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育1h，ECL试剂曝光显影。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组基本情况

MA组53例，孕周7～11周；对照组53例，宫内胎儿健康存活，孕期7～11周。对照组出血时间、月经复潮时间及出血量均少于MA组，子宫内膜厚度大于MA组(P<0.05)。见表1。

表1 两组手术及恢复情况比较

2.2 两组β-arrestin1和FGF21表达水平比较

qRT-PCR检测结果表明，MA组绒毛组织中β-arrestin1(0.738±0.15)及FGF21 mRNA(0.413±0.18)表达均低于对照组(1.613±0.19、1.288±0.29)(t=10.26、7.071，均P=0.000)。

2.3 两组p53/MDM2表达水平比较

Western blot检测结果表明，MA组绒毛组织中p53(1.394±0.12)、MDM2(1.581±0.16)表达高于对照组(0.485±0.09、0.285±0.05)(t=16.59、21.3，均P=0.000)。

2.4 p53/MDM2蛋白与β-arrestin1和FGF21 mRNA表达相关性

分析结果表明，MA组p53、MDM2与β-arrestin1及FGF21的表达均呈负相关(P<0.001)。见表2。

表2 各指标相关性分析

3 讨论

稽留流产是妊娠最常见的并发症之一。正常妊娠有一定程度的滋养层细胞凋亡，有利于绒毛的形成和发育[15]。然而，滋养层细胞过度凋亡可能导致绒毛发育异常或细胞滋养层变性，甚至导致妊娠终止[16]。因此，凋亡可能与稽留流产的发生密切相关。

有研究表明，β-arrestin1在许多细胞内信号转导通路中起调节作用[17]；此外，胰岛素样生长因子-1R的下游因子对p53的激活具有诱导β-arrestin1产生的作用。β-arrestin1通过E3-泛素连接酶将MDM2转移到细胞核，作为接头蛋白促进p53的结合和降解，导致DNA损伤[18]。然而，当MDM2识别p53靶点并与缺氧诱导因子-lα亚基结合时，介导缺氧诱导因子-lα降解，减少血管内皮生长因子表达，抑制血管生成，停止细胞周期，增加凋亡，最终导致稽留流产。本研究结果表明，稽留流产发生后，p53及MDM2表达水平均增高；β-arrestin1表达水平下降，推测是由于过度消耗所致。

MA潜在病因，特别是在内分泌学方面仍模糊不清。FGF21是一种有调节代谢系统作用的刺激因子。研究表明，FGF21可以增强血管生成[19]。本研究发现，与对照组比较MA组绒毛组织的FGF21含量下降，表明FGF21可能在抑制稽留流产的发生过程中发挥一定作用。相关性分析表明，稽留流产发生者p53、MDM2的表达与β-arrestin1及FGF21的表达均呈负相关，提示孕早期稽留流产的发生可能与p53/MDM2信号通路的激活有关。