果胶酶协同漆酶/谷氨酸体系改善OCC造纸强度性能的研究

陈樱珈 马邕文 王祥槐 许超峰 张凤山 许银川 万金泉，*

（1.华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室，广东广州，510640；2.瑞辰星生物技术（广州）有限公司，广东广州，510530；3.郑州运达造纸设备有限公司，河南郑州，451100；4.山东华泰纸业股份有限公司，山东东营，257335）

1 t 废纸可生产约0.8 t 再生浆，可代替约3～4 m3的木材，同时减少了有毒废物的排放，减少75%的空气污染和35%的水污染[1]。但是再生纤维利用也存在着成纸滤水性能差、纤维润胀性能差、纤维强度低等问题[2]，其被称为“纤维性能的衰变”，因此需要采取一些方法来提高再生纤维的质量。

生物酶具有修复效果好、反应条件温和、对纤维损伤小、对环境无二次污染等优点，被广泛应用于制浆造纸工业中[3-6]。漆酶可以去除木素，从而提高纸浆漂白性能，增强纤维强度性能，陈国政等人[7]用羧甲基壳聚糖协同漆酶预处理废旧瓦楞箱纸板（OCC），结果表明，经过协同体系处理后纸浆的白度和强度得到提高，纤维间排列紧密，酸不溶木素含量下降。有研究表明，氨基酸在漆酶氧化后可以与木素发生迈克尔加成反应，从而将羧基嫁接到纸浆纤维上，增加纤维的溶胀性能，从而提高纸张的强度性能[8]。

纤维表面存在着大量木素和抽出物，这些物质对纤维的覆盖不利于纤维的润胀，对后续纤维与其他药品反应有一定的影响[9]。果胶酶可以部分去除纤维表面的木素和提取物，暴露出更多的碳水化合物和木素，从而提高后续加工的效率[10]。张向东[11]通过漆酶/介体和果胶酶的协同处理杨木碱性过氧化氢机械浆（APMP），研究表明，漆酶/介体和果胶酶的协同处理可以增加APMP 纤维之间的结合力，提高纸张的物理强度。

本研究以OCC 为原料，研究了果胶酶协同漆酶/谷氨酸的复合酶体系预处理对OCC 纸张强度性能的改善，并用响应曲面法优化了酶预处理工艺条件，通过X 射线光电子能谱仪（XPS）、原子力显微镜（AFM）和傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）分析酶预处理对纤维表面物质和分子结构的影响。

1 实 验

1.1 原料与试剂

废旧瓦楞箱纸板（OCC），瑞辰星生物技术（广州）有限公司；漆酶（酶活110×104U/L）、果胶酶（3×104U/g），上海麦克林生化科技有限公司；谷氨酸，上海伯奥生物科技有限公司；碳酸氢二钠，分析纯，福晨（天津）化学试剂有限公司；碳酸二氢钠，分析纯，国药集团化学有限公司。

1.2 实验仪器

HH-4 数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；JB90-SH 恒速电动搅拌机（上海标本模型厂）；RK3AKWT 凯赛法自动抄纸器（奥地利PTI 公司）；CE062 抗张强度仪、CE180 耐破度测定仪、248 压溃测试仪、009撕裂度测试仪（瑞典L&W 公司）；NanoscopeIIIa 原子力显微镜（美国）；Axis Ultra DLD 光电子能谱仪（英国Krates 公司）；Vector 33 傅里叶变换红外光谱仪（德国Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 OCC浆板的处理

将OCC 浆板用手撕成合适尺寸的小片，于室温下在水中浸泡24 h，将泡好的废纸调节浆浓约10%，在50℃、300 r/min的碎浆机中碎浆25 min。碎浆完成后用浆袋过滤收集浆料，平衡水分24 h以上备用。

1.3.2 OCC浆料预处理

称取20 g 绝干OCC 浆料配成浆浓2%的纸浆，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠（Na2HPO4/NaH2PO4）缓冲溶液调节pH 值为6.0，在45℃的恒温水浴锅中搅拌（转速200 r/min），添加果胶酶预处理一段时间后，再添加漆酶和1%的谷氨酸（相对于绝干浆料）进行反应。反应结束后在沸水浴中灭活5 min。采用响应曲面法，利用Design Expert 软件设计4 因素3 水平实验确定最佳果胶酶用量、漆酶用量、果胶酶反应时间和漆酶反应时间。

1.4 抄纸及性能检测

利用凯赛法自动抄纸器抄造定量80 g/m2的手抄片，然后在105℃下干燥10 min。将手抄片在恒温恒湿实验室（温度（23±1）℃、相对湿度(50±2)%）放置12 h 后，分别按照GB/T 12914—2008、GB/T 454—2002、TAPPI T810om-98、TAPPI T414om-12 测定纸张的抗张强度、耐破度、环压强度和撕裂度。

1.5 X射线光电子能谱仪（XPS）分析

利用凯赛法自动抄纸器抄造定量80 g/m2的手抄片，将纸样放在干净的金属板表面上，于室温下风干。剪下一小块长宽不超过1 cm 的样品附着在平坦的玻璃表面上，用XPS 检测纸张表面C、O 元素的相对含量。测试条件：X 射线源采用铝靶，工作电压125 kV，电流20 mA，真空度3.1×107Pa。样品数据从C 1s峰进行曲线拟合，线形为高斯线形。

1.6 原子力显微镜（AFM）分析

采用AFM 分析纸浆纤维表面。称取约0.5 g 湿纸浆充分分散于200 mL 去离子水中，用胶头滴管吸取少量纸浆悬浮液，滴在刚劈开的云母片一面上，云母片另一面用双面胶粘于导电铁片上，室温风干后使用。每种纸浆做3个样品，并确保每个样品上有几根分散且完整的纤维。使用原子力显微镜在空气中采用轻敲模式成像。扫描速度为1.0 Hz，图像分辨率为512×512 像素，同时记录高度图像和相位图像，采用Nanoscope analysis 1.8软件分析图像。

1.7 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析

将绝干浆料样品与预先干燥的KBr粉末混合在玛瑙研磨机中研磨成粉末状，在压片模具中压成全透明的薄片进行分析。扫描频率范围400～4000 cm-1，分辨率4 cm-1，信噪比30000∶1（峰/峰值）。

2 结果与讨论

2.1 响应面优化分析

2.1.1 实验设计

在单因素实验的基础上，采用响应曲面法对预处理OCC的工艺条件进行优化。利用Design Expert软件中的Box-Behnken模型，以果胶酶用量（A，2～4 U/g）、漆酶用量（B，11～13 U/g）、果胶酶处理时间（C，50～70 min）、漆酶处理时间（D，140～160 min）为影响因子，抗张强度（Y）为响应值，设计实验方案，实验因素水平表见表1，实验方案和结果分析如表2～表3所示。

表1 实验因素水平表Table 1 Table of experimental variables

表2 实验方案和结果Table 2 Results of experimental design

2.1.2 响应曲面分析

在45℃、pH 值6.0、谷氨酸添加量1%（相对于绝干浆料）的条件下进行实验，实验结果用于多元回归拟合[12]。抗张强度的二阶多项式回归模型如式（1）所示。

表3 为回归模型方差分析表。由表3 可知，回归模型的F值（效应项与误差项比值）为19.87，F值越大表示处理效果越明显。回归模型的P值＜0.0001，表示回归模型的回归性好；且回归模型相关系数的平方R2=0.9521，调整确定系数的平方R2Adj=0.9042，表示回归模型拟合程度好，能够解释90%以上的响应值；失拟项P=0.6086＞0.05，无显著性差异，说明回归模型拟合度良好。因此，用该回归模型可以对果胶酶协同漆酶/谷氨酸体系预处理OCC 的强度性能进行分析。

表3 回归模型方差分析表Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for regression model

图1 显示了回归模型计算得出的抗张强度预测值与实验中纸张抗张强度实际值之间的关系。从图1 可以看出，实际值和预测值大部分分布在直线y=x上，说明该回归模型的预测性能良好，进一步说明了回归模型的有效性。以上分析表明该回归模型可以较准确地说明各个变量和抗张强度之间的关系，同时可以对OCC 预处理的最佳条件进行较为精准地预测。

图1 纸张抗张强度的预测值与实际值对比Fig.1 Comparison of observation and forecast of paper tensile strength

2.2 漆酶、果胶酶用量对纸张抗张强度的影响

图2 为漆酶、果胶酶用量对纸张抗张强度影响的响应曲面图。由图2可知，在相同果胶酶用量下，随着漆酶用量的增加，纸张抗张强度呈先增大后减小的趋势。原因是因为漆酶去除了部分木素，促进了微细纤维的暴露，增大了纤维间的结合力，从而使纸张的抗张强度增大。同时氨基酸的加入增加了纤维的羧基含量[8]，羧基含量的增加可以提高纤维的润胀性能和柔韧性。当漆酶用量增加到12.235 U/g 时，随着漆酶用量继续增加，纸张抗张强度呈现降低的趋势，因为谷氨酸在漆酶的作用下通过迈克尔加成反应将羧基嫁接在纤维上，从而增加纤维的羧基含量，因此谷氨酸含量不变时，羧基含量不变，继续增大漆酶用量对纸张强度的提升并未有明显的作用，故漆酶最佳用量为12.235 U/g。在相同漆酶用量下，随着果胶酶用量的增加，纸张强度呈先增大后减小的趋势。果胶酶可以去除部分纤维表面的抽出物和木素，使纤维内部的碳水化合物和木素暴露出来[10]，从而可以使漆酶更好地催化氧化木素，使细小纤维更好地暴露出来，促进纤维间的结合，表现为纸张抗张强度的增加。当果胶酶用量增加到3.508 U/g 时，继续增大果胶酶用量，纸张抗张强度呈现降低的趋势，过量的果胶酶加入会使纤维受到损伤，从而造成纤维强度降低，表现为纸张抗张强度降低，由此可以得出果胶酶最佳用量为3.508 U/g。

图2 漆酶、果胶酶用量对纸张抗张强度影响的响应曲面图Fig.2 Response surface of the effect of laccase dosage and pectinase dosage on the tensile strength of paper

2.3 酶预处理时间与酶用量对纸张抗张强度的影响

图3 为果胶酶预处理时间与漆酶、果胶酶用量对纸张抗张强度的响应曲面图。由图3可知，随着果胶酶预处理时间的增加，纸张抗张强度增加。当反应时间较短时，果胶酶对再生纤维的改性不充分，反应时间超过61.521 min 后，再延长反应时间，预处理效果不明显，纸张抗张强度甚至表现出下降趋势，果胶酶预处理时间过长可能会损伤纤维，从而降低纸张抗张强度。

图3 果胶酶预处理时间与酶用量对纸张抗张强度影响的响应曲面图Fig.3 Response surface of the effect of pectinase pretreatment time and enzyme dosage on tensile strength

图4 为漆酶预处理时间与漆酶、果胶酶用量对纸张抗张强度的响应曲面图。由图4可以看出，漆酶预处理时间对纸张抗张强度的影响不太明显，因为响应曲面分析选取的漆酶预处理时间是在单因素实验的基础上选取的，因此漆酶预处理时间已经处于最优值范围内，取模型预测值160 min为漆酶最佳预处理时间，由此可以得出最佳果胶酶预处理时间为61.521 min、最佳漆酶预处理时间为160 min。

图4 漆酶预处理时间与酶用量对纸张抗张强度影响的响应曲面图Fig.4 Response surface of the effect of laccase pretreatment time and enzyme dosage on tensile strength

2.4 最优处理条件

通过Design Expert 软件及实验数据分析得出OCC预处理的最优工艺条件为：果胶酶用量3.508 U/g、漆酶用量12.235 U/g、果胶酶预处理时间61.521 min，漆酶预处理时间160 min，结合实际操作考虑，最优组采用果胶酶用量3.5 U/g、漆酶用量12.2 U/g、果胶酶预处理时间62 min，漆酶预处理时间160 min。通过回归模型预测在此最优处理条件下抄造纸张抗张强度为2.55 kN/m；在最优条件下进行实验，抄造纸张的实际抗张强度为2.27 kN/m，由于处理条件与模型预测的处理条件不完全一致，因此最优条件下的实际纸张抗张强度值和预测抗张强度值有所偏差。

在最优条件下对OCC 分别进行果胶酶和漆酶/谷氨酸协同预处理（P-Lac/Glu，果胶酶用量3.5 U/g、漆酶用量12.2 U/g、果胶酶预处理时间62 min，漆酶预处理时间160 min），单独果胶酶预处理（Pectinase，果胶酶用量3.5 U/g，不添加漆酶和谷氨酸，其他反应条件与最优组相同），单独漆酶/谷氨酸预处理（Lac/Glu，漆酶用量12.2 U/g，不添加果胶酶，其他反应条件与最优组相同），对照组（Control，不加任何试剂，其他处理条件和最优组相同）。预处理后抄造纸张与对照组纸张的性能对比如表4所示。

由表4可知，与对照组相比，预处理OCC后抄造纸张的强度均得到了不同程度的提升，尤其在最优条件下预处理抄造纸张的抗张强度、耐破度、撕裂度、环压强度较对照组分别提高24.7%、33.7%、25.5%、31.1%，效果明显好于二者单独处理，这表明果胶酶与漆酶/谷氨酸具有协同效应。

表4 不同预处理条件下纸张性能对比Table 4 Comparison of paper properties under different pretreatments

2.5 XPS分析

对XPS 图谱中的C 1s 峰进行分解，可分为4 个小峰，即C1、C2、C3 和C4。C1、C2、C3 和C4 的峰面积比即碳原子比。①C1 代表只和碳、氢连接的碳原子（—C—H、—C—C），来源于纤维表面的木素和抽提物；②C2 代表用σ键连有1 个氧原子的碳原子（—C—O），来源于纤维素分子中的各个碳原子和木素中羟基或醚键相连的碳；③C3代表连有2个非羰基氧或1 个羰基氧的碳原子（O—C—O 或C=O），主要来源于木素分子中的酮基、醛基或纤维素分子的氧化产物；④C4 代表连有1 个羰基氧和1 个非羰基氧的碳原子（O—C=O）。C1 反映纤维原料中非碳水化合物的含量，即木素和抽出物的含量，C2 和C3 反映碳水化合物的含量，C4 的含量小，在XPS 中一般很难检测到。在纤维组分中，纤维素和半纤维素O原子含量多，抽出物和木素C 原子含量多，因此XPS 中O 原子的比例高代表纤维素的比例高，而木素和抽出物的比例小，O/C 比越高表示纤维表面暴露出的纤维素越多[13-14]。

图5 为不同预处理条件下纸浆纤维的C 1s 分峰曲线图，而各碳价态的变化情况如表5 所示。结合图5 和表5 可知，与未预处理的OCC 浆料相比，预处理后的OCC 浆料纤维表面C1 含量有不同程度的降低，C2 和C3 含量有不同程度的增加，O/C 数值有不同程度的增加，最优工艺条件下预处理OCC 浆料C1相对含量降低26.23%，C2 增加14.97%，C3 增加11.23%，O/C 增加27.88%。研究表明，碳价比可以反应纤维素、木素、抽出物的相对含量[15]。从O/C数值的增加，C1 含量的下降，C2、C3 含量的增加可以得知，经预处理后的OCC 浆料纤维表面木素和抽出物含量减少，碳水化合物含量增加，进一步证实了所选生物酶体系预处理对纤维表面木素和抽出物的去除作用。碳水化合物增加表示纤维表面暴露了更多的亲水性基团，纤维的吸水润胀性能增强，有利于纤维的分丝帚化和纤维间的结合，解释了预处理后OCC 成纸强度提升的原因。尤其是果胶酶和漆酶/谷氨酸协同体系预处理OCC 浆料后，各项指标达到最佳。

图5 不同预处理条件下纤维的C 1s 峰分峰谱图Fig.5 C 1s peaks of fibers under different pretreatment conditions

表5 不同预处理条件下OCC的O/C及C 1s峰分峰面积Table 5 O/C and C 1s peak areas of OCC under different pretreatment conditions

2.6 AFM分析

有研究表明，纤维的表面覆盖一层非纤维物质，即木素和抽出物，木素呈现不规则粒状结构，抽出物呈现类似球状的结构[16]。图6 为不同预处理条件下OCC 浆料纤维表面的AFM 图。由图6 可知，未预处理OCC 浆料纤维表面被颗粒状物质包裹着，基本看不见特定走向的微细纤维，而经过果胶酶、漆酶/谷氨酸、果胶酶和漆酶/谷氨酸协同预处理后的OCC 浆料纤维表面颗粒状物质均减少，特别是经过果胶酶和漆酶/谷氨酸协同预处理后的OCC 浆料纤维表面微细纤维走向明显。说明经过酶预处理可以使微细纤维更好地暴露出来，有利于纤维的分丝帚化，有利于增加纤维间的结合能力，从而提高纤维成纸强度，这一结果与XPS结果一致。

图6 不同预处理条件下纤维表面的AFM图Fig.6 AFM images of fiber surface under different pretreatment conditions

2.7 FT-IR分析

红外光谱分析采用基线法，1429 cm-1处左右为木素苯环骨架的伸缩振动吸收峰和碳水化合物—CH2变形振动吸收峰，其峰相对比较稳定，分析以此峰作为基准数值表示其他峰的强度。图7为不同预处理条件下OCC 浆的FT-IR 图。表6 为不同预处理条件下OCC浆纤维吸收峰的相对吸收强度。3349～3406 cm-1处为分子间氢键—OH 拉伸的吸收峰，从图7 和表6可以看出，与对照组相比，不同酶预处理后的OCC浆特征峰相对强度有不同程度的增加。这可能是由于不同酶预处理OCC 浆纤维后，纤维中的木素逐渐降解，进而产生更多的羟基，增强了纤维间的结合力，也可以解释预处理后的OCC 浆料有更好的物理性质。1373～1375 cm-1处是木素芳羟基O—H 变形振动和纤维素/半纤维素聚糖或脂肪族C—H弯曲振动，经过不同酶预处理后，纸浆在该处的吸收峰强度均增加，表明酶预处理会部分去除纸浆中含有的木素，提高碳水化合物的相对含量，和上述结论一致，果胶酶和漆酶/谷氨酸协同预处理的效果最好。

表6 不同预处理条件下FT-IR光谱中峰的吸收强度[16]Table 6 Absorption intensities of peaks in FT-IR spectra under different pretreatment conditions[16]

图7 不同预处理条件下OCC浆的FT-IR谱图Fig.7 FT-IR spectra of OCC pulp under different pretreatment conditions

3 结论

本研究采用果胶酶和漆酶/谷氨酸协同预处理废旧瓦楞箱纸板（OCC），采用响应曲面法优化工艺条件，探讨果胶酶和漆酶/谷氨酸协同预处理OCC 后抄造纸张的强度性能。

3.1 OCC 预处理的最优工艺条件为：果胶酶用量3.5 U/g，漆酶用量12.2 U/g，果胶酶预处理时间62 min、漆酶预处理时间160 min。

3.2 与未预处理OCC 抄造的空白纸张相比，在最优工艺条件下预处理OCC 抄造的纸张抗张强度提高24.7%，耐破度提高33.7%，撕裂度提高25.5%，环压强度提高31.1%。

3.3 X 射线光电子能谱仪（XPS）分析表明，与未预处理OCC 浆料相比，在最优工艺条件下预处理OCC 浆料的C1 相对含量降低26.2%，C2 相对含量增加15.0%，C3 相对含量增加11.2%，O/C 增加27.9%，表明纤维表面碳水化合物的相对含量增加，纤维表面暴露了更多的亲水性基团，纤维的吸水润胀性能增强，有利于纤维的分丝帚化和纤维间的结合。

3.4 通过原子力显微镜（AFM）对纤维形貌进行分析，辅助证明了XPS的分析结果，可以看出经过酶预处理后暴露出更多的微细纤维，更有利于纤维间的结合，提高纤维的强度；红外光谱表明，经过果胶酶和漆酶/谷氨酸协同预处理后，分子间氢键—OH 拉伸的吸收峰、木素芳羟基O—H变形振动和纤维素/半纤维素聚糖C—H 弯曲振动吸收峰强度增加，表明酶预处理会部分去除纸浆中含有的木素，提高碳水化合物的相对含量。

3.5 果胶酶和漆酶/谷氨酸协同预处理OCC比果胶酶和漆酶/谷氨酸单独预处理对抄造纸张强度性能提升的幅度更高，表明果胶酶和漆酶/谷氨酸具有协同效应。