NK细胞活化性受体及其配体在缺血性脑卒中模型小鼠脑组织中的表达变化*

陈秋竹，杜 欧，朱 丽，曹丽丽，杜俊蓉

1.四川大学 华西药学院(成都 610041)；2.成都大学 基础医学院(成都 610106)

脑卒中是我国成年人常见的脑血管疾病，其高发病率、高致残率和高病死率严重威胁着患者生命健康。缺血性脑卒中是临床脑卒中的主要类型，目前药物临床治疗效果有限[1]。研究[2]发现，缺血性脑卒中发病机制复杂，神经炎症反应、细胞内钙超载、兴奋性毒性、细胞凋亡和氧化应激等相互影响、重叠发生。近年来，研究[2-4]表明，脑缺血引起神经细胞损伤、坏死和凋亡，随后小胶质细胞激活、血源性免疫细胞浸润以及炎症因子的大量产生、释放，可触发严重的神经炎症反应。脑缺血后免疫炎症反应参与脑梗死的进展，影响卒中的严重程度和预后。因此，阐明脑缺血损伤的神经炎症分子机制具有潜在的临床转化意义。

NK细胞活化性受体(natural killer group 2 member D，NKG2D)是一种含有带电残基的Ⅱ型跨膜同源二聚体，表达于NK细胞、T细胞亚群等多种免疫细胞表面。NKG2D与多种配体结合后，通过接头蛋白DAP10传递活化信号，诱导促炎因子分泌增加，并发挥细胞毒作用[5-7]。NKG2D的配体由宿主自身基因组编码，是与MHC Ⅰ类分子相关的自体蛋白。研究[8-9]发现，人类表达的NKG2D配体有MICA、MICB和ULBP1-6，小鼠的NKG2D配体包括Rae-1、H60和Mult1。NKG2D配体在正常细胞中一般不表达或低表达，但细胞在恶变或受到感染等病理条件下，NKG2D配体的表达通常上调[5]。多种因素可调节NKG2D受体或其配体的表达，从而介导炎症反应。研究[10-11]报道，NKG2D受体与其部分配体参与了类风湿性关节炎、结肠炎、多发性硬化症等多种炎症性疾病和自身免疫性疾病的发生发展，阻断NKG2D,抑制自发性肠炎。但NKG2D受体与脑缺血神经炎症的关联性尚未见报道。因此，本研究拟通过检测缺血性脑卒中模型小鼠脑组织中NKG2D及其配体、促炎因子的表达变化，探究NKG2D在缺血性脑损伤炎症反应中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性6周龄C57BL/6小鼠24只，体重20～24 g，成都达硕生物科技有限公司提供[合格证号：SCXK(川)2020-030]。动物常规饲养于四川大学华西药学院动物房[合格证号：SYXK(川)2013-113]。

1.2 材料和试剂

双通道小动物气体麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；光学显微镜(日本尼康株式会社)；定量PCR仪(瑞士Roche公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；焦油紫(德国Chroma-Gesellschaft公司)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、SsoFastTMEvaGreen®Supermix(美国Bio-Rad公司)；TRIzol裂解液(美国Invitrogen公司)；冷冻切片包埋剂(美国SAKURA樱花公司)；NKG2D、H60、Rae-1、Mult1一抗(美国R&D公司)；二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG抗体(杭州华安生物科技有限公司)。

1.3 动物分组及小鼠脑缺血再灌注模型的建立

C57BL/6小鼠适应性饲养1周，参照双侧颈总动脉持久性结扎法(two-vessel occlusion,2VO)造模[12]，构建小鼠全脑缺血再灌注损伤模型组(2VO组)。小鼠在30% O2与70% N2O的异氟烷(浓度为1.0%～1.5%)麻醉下仰卧位固定，暴露双侧颈总动脉，剥离迷走神经，动脉夹夹闭双侧颈总动脉20 min后松开，并确保再灌注成功。假手术对照组(Sham组)仅暴露双侧颈总动脉，不进行夹闭。每组12只小鼠。

1.4 取材

脑缺血再灌注72 h后，腹腔注射4%水合氯醛麻醉，剪开胸腔使心脏暴露，剪破右心耳，将2VO组和Sham组小鼠分别随机分为A、B两组，每组6只。A组用预冷生理盐水灌流后取出大脑，液氮急冻后加入TRIzol试剂，用于实时荧光定量PCR检测和蛋白质印迹技术检测。B组依序用预冷生理盐水、4%多聚甲醛灌流，取大脑于4%多聚甲醛中固定过夜，常规冷冻切片包埋剂包埋，进行冰冻切片(20 μm)用于Nissl染色。

1.5 Nissl染色

Nissl染色检测2VO诱导的神经元损伤[13]。冰冻切片于0.5%焦油紫水溶液染色10 min，镜下分色晾干后，封片。显微镜下(×400)，用Image-Pro Plus 6.0软件分别盲法计数海马CA1区和纹状体CPu区存活神经元总数，以评价2VO造成的大脑神经元损伤程度。

1.6 实时荧光定量PCR检测

TRIzol法提取小鼠脑组织总RNA，逆转录为cDNA后进行实时荧光定量PCR反应。NKG2D及其配体、胞内接头蛋白DAP10、炎症因子的引物序列[14-18](表1)。NKG2D、H60、Rae-1、Mult1、DAP10、TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA水平归一化为GAPDH。结果表示为使用2-△△Ct方法相对于空白对照组的阈循环(Ct)值的倍数变化。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.7 蛋白质印迹技术检测

提取各组小鼠脑组织总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。蛋白样品经SDS凝胶电泳分离，电转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白条带,封闭后再将膜分别与NKG2D、Rae-1、H60、Mult1、β-actin抗体于4 ℃孵育过夜(抗体滴度分别为1∶500、1∶1 000、1∶500、1∶400和1∶1 000)。弃去一抗，洗涤后将PVDF膜分别与二抗(抗体滴度为1∶4 000)在室温孵育1 h。最后采用化学发光法通过显色液检测目的条带，用凝胶成像仪拍照并测定各目的条带的灰度值。以目的蛋白/β-actin灰度的比值为各目的蛋白的相对表达量。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 脑缺血小鼠神经元损伤比较

2VO全脑缺血主要表现为神经元损伤。2VO小鼠的海马CA1区和纹状体CPu区存在明显的神经元损伤[19-20]。脑缺血再灌注72 h后，与Sham组相比，2VO组小鼠海马CA1区和纹状体CPu区神经元深染、固缩，存活的神经元总数明显少于Sham组(P<0.001),结果表明2VO对小鼠的神经元造成了严重损伤(表1、图1)。

表1 两组脑缺血小鼠神经元损伤比较(个,

图1 脑缺血造成小鼠神经元损伤(n=6)

2.2 小鼠脑组织中NKG2D受体及其接头蛋白DAP10的表达

与Sham组相比，2VO组小鼠脑组织中NKG2D受体的mRNA表达及蛋白表达水平明显上升(P<0.05);NKG2D接头蛋白DAP10的mRNA表达水平明显上升(P<0.001)。结果表明，脑缺血再灌注可能激活NKG2D受体信号通路(表2～3、图2)。

表2 两组NKG2D受体和DAP10的mRNA表达水平比较

表3 两组NKG2D受体的蛋白表达水平比较

图2 NKG2D受体及DAP10的表达水平及NKG2D受体的蛋白表达水平

2.3 小鼠脑组织中NKG2D配体的表达

与Sham组相比，2VO组小鼠脑组织中NKG2D配体(H60、Rae-1、Mult1)的mRNA表达和蛋白表达水平均明显上升(P<0.05)。结果表明，2VO脑缺血后再灌注可上调H60、Rae-1、Mult1等多个NKG2D配体的表达(表4～5、图3)。

表4 两组NKG2D配体mRNA表达水平比较

表5 两组NKG2D配体的蛋白表达水平比较

图3 小鼠脑组织中NKG2D配体的mRNA及蛋白表达水平

2.4 小鼠脑组织中促炎因子的表达

与Sham组相比，2VO组小鼠脑组织中促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS)的mRNA水平均明显上升(P<0.001)。结果表明，脑缺血后再灌注可加重小鼠神经炎症反应(表6、图4)。

表6 两组促炎因子的mRNA表达水平比较

图4 小鼠脑组织中促炎因子的mRNA表达水平(n=6)

3 讨论

神经炎症是缺血性脑卒中发生发展的重要病理生理基础，且影响其预后。研究[2]发现，减少脑缺血后炎症反应发生、促进炎症反应消退、抑制小胶质细胞/巨噬细胞极化等都能有效减轻神经炎症带来的脑损伤，但目前针对神经炎症，临床上缺乏有效的干预措施。因此，阐明脑缺血后神经炎症的病理机制,寻找安全有效的干预靶点尤为重要。

脑缺血模型主要包括全脑缺血模型和局限性脑缺血模型。2VO法通过阻断双侧颈总动脉模拟脑血流灌注不足引起的急性全脑缺血性脑损伤，属于全脑缺血模型[21]。全脑缺血模型主要观察神经元损伤，尤其是海马CA1区和纹状体的神经元[13]。全脑缺血发生后，神经元的基本结构和功能均会发生明显变化[22]。本研究中，2VO小鼠模型中海马CA1区和纹状体CPu区神经元深染、固缩，神经元数量明显少于Sham组，提示脑缺血再灌注后，小鼠脑组织损伤严重，2VO模型建立成功。

NKG2D是表达于NK细胞、T细胞等表面的重要活性化受体，已被证明在抗肿瘤免疫、抗感染免疫及免疫系统疾病中发挥重要作用[23]。小鼠NKG2D配体主要包括H60、Rae-1和Mult1，在应激状态下表达增加。该配体与NKG2D结合后作为共刺激分子,通过激活接头蛋白DAP10及下游信号通路，从而促进细胞增殖及激发免疫细胞(NK细胞和T细胞)的细胞毒作用，发挥免疫监视和免疫调节作用[7]。此外，免疫细胞表面的NKG2D被激活后，可通过PI3K/STAT5和Syk/ZAP70两条信号通路刺激效应细胞因子产生，发挥促炎作用[23]。在肾缺血-再灌注损伤中，NKG2D与配体的结合可活化NK细胞，加重肾小管上皮细胞损伤[24]。本研究发现，2VO组小鼠缺血脑组织中NKG2D及NKG2D配体(H60、Rae-1、Mult1)的mRNA水平和蛋白表达水平均增加；同时NKG2D接头蛋白DAP10的mRNA表达上调。研究[25]表明，脑缺血发生后，缺血大脑释放大量促炎细胞因子和炎症介质。本研究结果显示，2VO小鼠脑组织中的炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS mRNA水平升高，表明2VO小鼠缺血脑组织中神经炎症反应增强。

综上所述，2VO介导脑缺血发生后，NKG2D及其配体表达上调，相互结合激活接头蛋白DAP10和下游信号通路，促进炎症因子的产生。本研究结果提示，NKG2D受体信号通路可能在脑缺血再灌注损伤炎症反应中发挥了重要作用，但具体调节机制仍需进一步研究。