VicK磷酸酶活性调控变异链球菌主要毒力的转录组学分析*

龙 莉，杨 鑫，曾杨林，王一然，李一洲，黄麟婷，陈文川，王诗达

口腔疾病研究国家重点实验室·国家口腔疾病临床医学研究中心·四川大学华西口腔医学院(成都 610041)

变异链球菌(Streptococcusmutans，S.mutans)具有强大生物膜形成、利用碳水化合物产生有机酸以及自身耐酸的能力，其被认为与龋病的发生发展密切相关。研究[1-2]表明，龋病患者牙体组织表面的S.mutans数量比健康人高30%。口腔中S.mutans面临复杂的环境变化，能够感知并适应环境胁迫，包括pH、温度、氧化还原电位、渗透压和有毒化学物质等，对其生存至关重要。S.mutans的VicRK双组份信号转导系统(two-component system，TCS)参与细胞分裂、生物膜形成和细胞壁合成等生命过程[3-4]。VicRK TCS由跨膜组氨酸激酶VicK及其胞内同源效应调节因子VicR组成。VicK蛋白同时具有激酶和磷酸酶活性，其激酶活性可将磷酸基团传递给同源的VicR蛋白引发其构象变化，继而影响下游基因的表达。VicK的磷酸酶活性可以移除VicR～P的磷酸基团，使VicR～P/VicR维持在正常水平[5-6]。两种酶的相互拮抗共同维持着细胞的生存和致病性。

vicK缺失突变株(ΔVicK)中gtfB/C/D(分别编码葡糖基转移酶B/C/D)和gbpB(编码葡聚糖结合蛋白)表达降低，细胞分裂异常，形成细胞长链[6-8]。DNase Ⅰ免疫印迹法和凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)证实,gtfB、gtfC、ftfs、gbpB表达直接受VicR控制[4,7];同时,ΔVicK的胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)释放增加，对高渗透压胁迫和氧化胁迫的敏感性增高，提示VicRK TCS在细胞壁生物合成和胁迫耐受中起着重要作用[3]。与细胞自溶、胁迫耐受相关基因，如wapE、lysM、atlA、samA、sodA和dpr，被证明是VicR的靶基因[6,9]。Senadheera等[10]报道,与细菌素合成相关的nlmC及bsmH基因的启动子区域可以直接被纯化的VicR蛋白结合，提示VicRK参与调节S.mutans细菌素合成。

此前的研究主要集中探讨VicK激酶活性的功能，并将其视为调节S.mutans致病性的潜在靶点，但对VicK磷酸酶活性的研究[11-12]较少。S.mutans中VicK的晶体结构提示第222位脯氨酸及第221位苏氨酸均为VicK磷酸酶活性关键氨基酸。体外活性实验[9]证实，T221A(丙氨酸替换第221位苏氨酸)或P222A(丙氨酸替换第222位脯氨酸)的突变可完全阻断VicK磷酸酶活性，同时保留其激酶活性。因此，近期有研究[13]构建了S.mutans的VicK点突变株VicKP222A，进一步分析胞内VicK磷酸酶活性的生物学效应。通过检测指数生长中期S.mutans胞内VicR磷酸化水平，发现VicKP222A突变株胞内VicR～P大量积累(≈90%)；VicK磷酸酶活性缺失使得编码合成不溶性多糖基因(gtfB/C)的表达降低，而与水溶性多糖合成相关的基因(gtfD、ftf)则增加。唾液凝集实验[13]发现，VicKP222A细菌聚集速度低于野生对照株。以上实验结果均提示,VicK磷酸酶活性可能是抑制S.mutans生物膜形成的潜在靶点。

为更深入了解VicK磷酸酶活性在S.mutans中的生物学作用，本研究对VicKP222A和野生对照株进行了全转录组分析。根据差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)分析结果的提示，对S.mutans细菌生存和致病性相关的表型进行测定，并通过实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)验证其对应基因表达。检测VicK磷酸酶活性缺失对S.mutans造成的应激耐受、eDNA释放/细胞自溶、细菌素合成等生命过程的影响。

1 材料和方法

1.1 细菌培养

本实验使用了S.mutans野生对照株(UASpec)、VicK的点突变株(VicKP222A)以及血链球菌(Streptococcussanguis,S.sanguinis)[13]。S.mutans在脑心浸液(brain heartlnfusion medium，BHI)肉汤中培养，培养基中添加1 000 mg/L的壮观霉素,在37 ℃、5%CO2的混合空气中生长。

1.2 转录组测序

S.mutans过夜培养后稀释20倍继续培养至OD600nm=0.5。分别取20 mL培养物用于RNA提取。使用TRIzol试剂(Invitrogen,USA)提取总RNA，并根据商家说明使用带有gDNA Eraser的PrimeScriptTMRT试剂盒(Takara,Japan)进一步纯化和消化。通过Nanodrop ND 1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，USA)测定纯化RNA的浓度，同时在标记前通过标准变性琼脂糖凝胶电泳评估RNA样品的完整性和质量。使用TruSeq RNA样品制备试剂盒(San Diego,CA)和总RNA制备转录组测序(RNA-seq)链的特异性文库[14]。使用RiboZero rRNA去除试剂盒(Epicenter,USA)去除rRNA，并对样本RNA进行片段化处理。根据Illumina方法进行cDNA合成、末端修复、A碱基添加和连接。在2%低范围超琼脂糖上，对200～300 bp的cDNA靶片段进行大小选择，然后使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行15个PCR循环的扩增。经TBS 380定量后，对末端文库进行Illumina NovaSeq 6000测序。使用DAVID生物信息学资源6.7(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)对DEGs进行基因注释富集分析和功能注释聚类。

1.3 渗透压耐受

S.mutans过夜培养后用预热的新鲜BHI培养基稀释20倍继续培养至OD600nm=0.6。取2 μL菌液接种到含有198 μL预热的新鲜BHI培养基的96孔板中(含或不含0.5 mol/L NaCl)。使用50 μL矿物油封闭菌液。SpectraMax 340PC384微孔板分光光度计(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在OD600nm监测生长12 h，每30 min测定1次OD值。仅含有BHI和矿物油的孔作为空白对照。将3个独立实验获得的数据生成生长曲线。

1.4 氧化应激

S.mutans过夜培养后用预热的新鲜BHI培养基稀释20倍继续培养至OD600nm=0.3。离心收集的菌体细胞用0.1 mol/L甘氨酸缓冲液(pH7.0，含或不含0.2% H2O2)重悬。在添加H2O2前后的不同时间点(0、15、30、45 min)收集50 μL样品并进行梯度稀释104、105、106倍。将稀释的菌液样本均匀铺在BHI固体培养基平板上。BHI平板在含5% CO2的有氧培养箱中37 ℃培养48 h，计数板上生长的菌落。本实验每组样本设3个生物学重复和3个技术重复。

1.5 RT-qPCR

S.mutans过夜培养后稀释20倍继续培养至OD600nm=0.4。使用TRIzol试剂(Takara，Japan)提取总RNA，并根据商家说明使用PrimeScriptTMRT Master Mix(Takara，Japan)逆转录合成cDNA，然后使用SYBR Green PCR试剂盒(Takara，Japan)进行RT-qPCR测定转录水平。以16S rRNA作为内参，采用相对定量的方法，通过2-ΔΔCt法计算分析目的基因相对表达水平，获得实验组与对照组的表达差异。所使用的RT-qPCR引物(表1)。

表1 RT-qPCR反应引物

1.6 eDNA测定

S.mutans过夜培养后用预热的新鲜BHI培养基稀释20倍继续培养至OD600nm=0.4。将菌液稀释105倍并在平板中均匀涂布，培养过夜，计数菌落(colony-forming units,CFU)。同时，使用0.22 μm膜过滤器(Millipore)过滤剩余的培养物以获取培养液上清，以16S rRNA为特异性引物，通过RT-qPCR扩增滤液中的eDNA进行半定量分析。将16S rRNA每次扩增获得的循环阈值(cycle threshold,CT)与使用已知量的UA159基因组DNA绘制的标准曲线比较，以量化每个样品中存在的未知量的eDNA，最终结果使用CFU进行标化。

1.7 平板拮抗实验

S.mutans与血链球菌过夜培养后用预热的新鲜BHI培养基稀释20倍继续培养至OD600nm=0.5。变异链球菌与血链球菌取10 μL样本以3 h间隔顺序接种或同时接种在半限BHI平板或富含营养的BHI平板(BHI平板加0.1%蔗糖)上。将平板置于37 ℃，含5% CO2的环境中孵育过夜。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 VicK磷酸酶活性缺失对S.mutans转录谱的影响

本研究进行了全转录组分析，以探索抑制S.mutansVicK磷酸酶活性时基因转录变化的全貌。结果表明，与野生型菌株UASpec相比，VicKP222A突变株中387个基因上调，423个基因下调(图1A)。根据从美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)获得的S.mutansUA159基因组注释，大多数DEGs功能是推定或未知的。在这些表达变化的基因中，已知功能的基因主要与辅酶代谢、信号转导机制、无机离子转运代谢、脂质代谢、碳水化合物转运代谢转录相关(图1B)。

为了更清楚了解DEGs的功能分类，进行了KEGG和GO分析。结果显示，VicKP222A的DEGs在 3个KEGG途径和8个GO的富集差异有统计学意义(P<0.05)。在KEGG中，上调的DEGs主要参与叶酸生物合成和TCS，下调的DEGs主要参与ABC转运蛋白。在 GO中，可将DEGs按功能分为：其他生物体的反应、对外部生物刺激的反应、防御反应、对其他生物体的防御反应、信息素活性、对细菌的防御反应、对细菌的反应及受体结合，且DEGs均呈现下调趋势(图1C)。

图1 VicKP222A转录组分析

此外，在VicKP222A突变株中有51个基因转录水平发生至少4倍的改变(P<0.001)，其中22个基因下调，29个基因上调(表2～3)。与胞外水不溶性多糖合成密切相关的gtfC和gtfB的转录分别下降>50倍和16.91倍，而与胞外水溶性多糖合成相关的gtfD和ftf的转录上调14.69倍和20.33倍(P<0.05)，同既往报道[13]的变化趋势一致。此外，参与麦芽糖转运的相关基因(malG，malF)和麦芽糖ABC转运蛋白底物结合蛋白(malX)表达下调，表明VicK磷酸酶活性缺失的状态下S.mutans转运和利用麦芽糖的途径可能受到一定阻碍。

表2 转录水平上调超过4倍的基因列表

表3 转录水平下调超过4倍的基因列表

2.2 同S.mutans细胞生存和致病性表型相关的DEGs

除了细胞分裂和细胞外多糖合成外，VicRK还调节S.mutans生存和致病性的其他细胞特征，如产酸和抗酸、应激耐受、eDNA释放和细菌素合成。根据转录组分析结果，本研究将细胞相关基因的转录进行了归纳(表4)。VicKP222A和UASpec组产酸和耐酸基因的表达差异无统计学意义(P>0.05)，而UASpec组中涉及氧化和渗透应激、eDNA释放和细菌素合成的基因表达差异有统计学意义(P<0.05)，表明这些细胞表型可能受到VicK磷酸酶活性被抑制的影响。

表4 常见S.mutans生存与致病性相关表型对应的DEGs

2.3 抑制VicK磷酸酶活性对S.mutans细胞胁迫耐受的影响

VicKP222A突变株与UASpec相比，在无胁迫条件下的生长速度较慢，VicKP222A表现出对高渗透压刺激(0.5 mol/L NaCl)较低的敏感性(图2A)。RT-qPCR检测与高渗透压耐受相关基因(包括naoX、sodA、prtM和trk)的表达发现，prtM(编码蛋白酶成熟脂蛋白)和trk(编码K+转运蛋白)在VicKP222A突变株中相比野生对照株,出现明显的上调(P<0.05)(图2B)。H2O2杀伤实验表明，UASpec和VicKP222A在暴露于含0.2% H2O2BHI中45 min后存活率均降低，且组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，但VicKP222A暴露于该刺激条件下15、30 min时存活率较UASpec降低(图2C)。RT-qPCR结果显示，在0.2% H2O2刺激下，氧化应激相关基因(tpx、ahpC、sodA、dpr、nox)的表达水平增加，出现与细菌表型相反的趋势(P<0.001)。

图2 VicKP222A应激耐受分析

2.4 抑制VicK磷酸酶活性对细胞自溶的影响

研究表明，eDNA释放与细菌自溶活性呈正相关。考虑到VicRK在细胞壁稳态中的调节作用，分析了S.mutans培养物上清液中eDNA的含量以探讨VicK磷酸酶活性对细胞自溶活性的影响。实验发现，VicKP222A培养物上清液中的eDNA含量以CFU标准化后约为野生对照株的10倍(P<0.01)(图3A)。RT-qPCR分析与自溶活性相关的VicR靶基因的表达水平，发现与UASpec相比，VicKP222A中atlA、lrgB和ccpA的表达水平分别上调1.9、2.3、1.3倍(P<0.01)(图3B)。

图3 VicKP222A细胞自溶分析

2.5 VicK磷酸酶活性缺失对S.mutans与S.sanguinis相互拮抗的影响

S.mutans合成的细菌素对其拮抗微生物具有抑制作用。S.sanguinis是S.mutans的拮抗菌株，也是牙菌斑中最常见的链球菌之一。为了探究VicK磷酸酶活性在S.mutans与S.sanguinis拮抗过程的作用，本研究进行了平板拮抗实验。与UASpec相比，当S.mutans作为早期定植者时，VicKP222A在营养有限或营养丰富的培养条件下,对S.sanguinis均表现出更强的抑制作用。然而，当同时接种两种细菌或S.mutans为后来定植者时，两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)(图4A)。RT-qPCR结果显示，VicKP222A突变株中nlmA、nlmB、nlmC表达无明显变化，nlmD的表达量约为UASpec中的2倍，但差异无统计学意义(P>0.05)。值得注意的是，VicKP222A突变株中bsmI的表达相比于野生对照株上调了>10倍(图4B)。

图4 VicKP222A细菌素合成分析

3 讨论

VicRK TCS广泛参与细菌细胞分裂、细胞壁生物合成及稳态调控。在S.mutans中vicK的敲除使得生物膜形成异常、细胞呈长链状、对环境胁迫的敏感性增强、细菌素合成减少和自溶活动增强等，以上实验结果体现的是vicK基因整体缺失后S.mutans的生物学属性变化[15]。VicK蛋白同时具备激酶及磷酸酶双重活性，目前这两种活性是如何切换以维持S.mutans正常生理尚不清楚。因此,前期通过氨基酸点突变构建了VicK磷酸酶活性缺失菌株VicKP222A，并证实VicK磷酸酶活性缺失导致S.mutans合成胞外水不溶性多糖降低，同时唾液诱导的S.mutans凝集作用大大减弱[13]。本研究对VicKP222A突变株的全转录组分析揭示，VicK磷酸酶活性缺失导致810个基因的表达发生变化。其中多糖合成相关基因(gtfB、gtfC、gtfD、ftf)、细胞壁稳态(wapE)、细胞粘附相关基因(spaP)和麦芽糖转运相关基因(malX、malG、malF)的转录变化明显。除蔗糖外，麦芽糖也是S.mutans的能量来源之一。malX、malG和malF的下调提示麦芽糖的运输和利用可能减少。Mal转运系统并非麦芽糖转运的唯一途径，多糖代谢系统也参与麦芽糖的运输[16]。

S.mutans在口腔中面临复杂多变的环境刺激，牙面成熟的牙菌斑可以达到几百毫米的厚度，细菌必须耐受较大的渗透压差[17]。Wood等[18]证明,细菌适应高渗环境包括3个阶段：1)脱水；2)调整细胞质溶剂的组成并补水；3)细胞重塑。许多细菌因缺乏水分运输机制，无法在高渗透压胁迫下存活。钾离子(K+)在第2阶段起着重要作用，因为K+可以迅速进入细胞以维持细胞质膨胀，防止细菌因失水过多而死亡。在S.mutans中trk基因编码K+转运蛋白，位于细胞膜表面的PrtM也有助于K+的跨膜转运，prtM突变株对高渗透压胁迫的敏感性较野生株明显增加[19]。VicKP222A突变株与UASpec相比,显示出在高渗透压胁迫下更强的适应性。RT-qPCR分析发现,trx和prtM的转录水平在VicKP222A中增加，提示VicRK和这些基因之间可能存在相互作用。然而，目前尚没有DNaseI足迹分析和电泳迁移率变动实验(EMSA)显示VicR可直接调控trx和prtM的表达。ABC转运蛋白Opu家族负责相容性溶质的转运，也参与细菌耐受渗透压胁迫的过程[17]。RT-qPCR分析发现,opuA的表达在VicKP222A菌株中没有明显变化。

ΔVicK与野生株相比,对氧化胁迫表现出更高的敏感性，提示VicRK TCS参与调控S.mutans氧化胁迫的耐受[15]。VicK的PAS结构域是氧化应激的感受器，当信号传递到VicR时，与氧化应激耐受相关的靶基因被上调以适应环境[17]。本研究证实,与UASpec相比，VicKP222A对H2O2的敏感性更高，但多次测试发现,参与氧化胁迫耐受基因(tpx、ahpC、sodA、dpr和nox)的表达呈现相反的趋势，提示独立于上述基因外的其他机制作用。

浮游状态下，VicKP222A突变株上清液中eDNA含量与野生对照株相比增加了近10倍。过去研究[9,20]发现,VicRK TCS调控altA、lrgB和ccpA基因转录，它们所编码的蛋白参与S.mutans的细胞自溶过程，altA、lrgB、ccpA以及vicK的基因敲除株都表现出eDNA释放的增加。RT-qPCR实验发现,以上3个基因的转录水平在VicKP222A突变株中均有所升高，提示VicK磷酸酶活性缺失可能通过促进自溶相关基因的表达增强了S.mutans细胞自溶，最终导致其eDNA释放增加。

S.sanguinis是口腔生物膜的另一常见菌，其通过合成H2O2(丙酮酸氧化酶的催化产物)和精氨酸代谢产生的NH3来抑制S.mutans，S.mutans则通过合成细菌素与其对抗[17]。平板竞争实验表明，当S.mutans作为早期定植者时，VicKP222A在营养有限和营养丰富的培养条件下,与野生对照株相比,对S.sanguinis表现出更强的抑制作用。VicKP222A中细菌素编码基因nlmA、nlmB和nlmC的表达没有明显变化，nlmD略有升高，而bsmI的表达上调了大约10倍以上。ComDE TCS被认为是与细菌素合成相关的经典调控系统之一，且在comC(编码CSP)编码区内发现了1个保存完好的VicR结合位点(TGTWAH-N5-TGTWAH)，DNase Ⅰ免疫印迹证实了VicR与该序列的结合。因此,推测VicK磷酸酶活性的抑制可能会激活VicRK与ComCDE之间的相互作用，继而调控S.mutans细菌素的合成[10]。

综上所述，本研究证实,VicK磷酸酶活性的缺失全面且明显改变了S.mutans转录谱，并探究了VicK磷酸酶活性在S.mutans耐受胁迫、细胞自溶和细菌素合成中的作用。在VicK磷酸酶活性缺失后，S.mutans胞外水不溶性多糖的合成、细胞凝集和对氧化胁迫的耐受均受到明显抑制;同时细菌对高渗透压胁迫的耐受、细胞自溶和细菌素合成增强。由此表明，VicK磷酸酶活性的缺失降低了S.mutans致龋关键毒力——生物膜的形成，有望成为龋病防治的新药物靶点；VicK磷酸酶活性对S.mutans生存和致病性的调控作用是多方面且复杂的，未来需要开展更多的实验以探究其调控机制。