牙髓干细胞通过调控TGF-β1/Smad2/3信号通路抑制肺纤维化的发生

李晓飞 刘颖 付崇建

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种致死性肺部疾病，全球发病率逐渐升高，自诊断之日起中位生存期为3～5 年[1]。从分子角度来看，IPF的发病过程伴随着多种纤维化相关基因的表达，如ACTA2， FN1， Col1a1， Col3a1的表达升高[2]。在IPF发生和加重的过程中，肺泡上皮细胞的迁移和转化扮演了至关重要的角色[3]。研究表明TGF-β信号可能导致肺泡上皮向间质细胞转化，从而使其失去细胞黏附能力和基底特异的细胞极性[4]。因此，靶向TGF-β信号通路，抑制肺泡上皮细胞的间质转化过程，可能是潜在的缓解肺纤维化的手段。

牙髓干细胞是一种间充质干细胞[5]。牙髓干细胞的收集只需要进行非侵入性手术，可在普通外科手术中摘除多余牙齿或智齿中进行[6-7]。研究报道牙髓干细胞已经在研究中被应用于神经系统支持体系等重建，牙颌面部软硬组织的修复和免疫系统的特异性调节[8]。然而，目前尚无研究探索牙髓干细胞对肺泡上皮细胞间质转化的调节能力以及其对于肺纤维化的的作用。该研究通过建立博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型并通过尾静脉注射人牙髓干细胞来探索牙髓干细胞对肺纤维化的缓解作用，并探究其潜在的分子机理。

1 资料与方法

1.1 人牙髓干细胞的分离和培养

2020 年10 月期间收集无龋坏和炎症的完整智齿，用于此项研究。人牙齿的获取和对牙齿的处理均经过了解放军960医院伦理审查委员会的审批。采用联合酶消化法获取牙髓干细胞。使用孔径为60 μm的细胞筛网过滤牙髓干细胞混合物，并用含双抗和20%胎牛血清(Gibco公司， 新西兰)的DMEM培养基收集细胞[9]。

1.2 动物

C57BL/6J背景的成年小鼠被饲养在解放军960医院实验动物中心。所有的实验程序和规程均获得了解放军960医院动物使用与保护伦理委员会的审批[批号: (2022)科研伦理审第(48号)]。

1.3 肺纤维化模型建立和hDPSCs处理

成年C57BL/6J小鼠被随机数字法分为4 组，每组16 只。对照组(Ctrl)：接受生理盐水气管注射(2 mg/kg)。博莱霉素组(BLM)：接受2 mg/mL博莱霉素(Sigma公司， 美国)溶液气管注射(2 mg/kg)。hDPSCs-1组：接受2 mg/mL博莱霉素溶液气管注射(2 mg/kg)和并通过尾静脉注射数量为1×105牙髓干细胞(BLM处理后第3 天进行)。hDPSCs-2组：接受2 mg/mL博莱霉素溶液气管注射(2 mg/kg)和并通过尾静脉注射数量为1×105牙髓干细胞(BLM处理后第7天进行)。BLM处理后28 d处死小鼠取肺组织。

1.4 肺组织干重和肺系数计算

肺组织取下后立刻称重，记录为湿重。同时测量肺的长度。将肺组织放入80 ℃烘箱中24 h，彻底烘干肺脏内的水分，称重，记录为干重。肺系数计算公式为：肺系数=湿重(g)/小鼠体重(g)。

1.5 HE染色和Masson染色实验

按照操作说明书使用HE染色试剂盒、 Masson染色试剂盒(Abcam公司， 英国)对组织切片进行HE和Masson染色。

1.6 酶联免疫吸附实验(ELISA)

本实验中使用ELISA试剂盒(Abcam公司, 英国)，按照试剂盒内说明书进行操作。

1.7 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

使用氯仿和异丙醇从组织中提取RNA。GAPDH用作阴性对照。引物序列如表 1。

表 1 引物序列

1.8 Western-blot实验

RIPA缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司)被用来提取组织中的蛋白质。Smad2/3 抗体、 磷酸化Smad2/3抗体(p-Smad2/3, Abcam, 英国)； E-cadherin抗体、 Vimentin抗体、 GAPDH抗体(Cell Signaling Technology, 美国)被用来与蛋白进行免疫结合。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 hDPSCs的处理缓解了BLM诱导的小鼠肺纤维化症状

流氏分析被用来检测细胞表面标志物以鉴定hDPSCs，包括CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19(图 1)。HE染色显示，BLM气管注射导致小鼠正常肺脏结构完全破环，包括肺泡结构丧失和肺泡实质化。而在BLM处理后第3天和第7天向小鼠尾静脉内注射1×105个hDPSCs，则可以延缓BLM对小鼠肺泡结构的破坏(图 2A)。Masson染色实验表明，BLM气管注射导致小鼠肺脏内严重的纤维增生。而尾静脉内注射hDPSCs可以抑制纤维增生和胶原沉积(图 2B)。BLM诱导小鼠的相对肺脏干重上升(图 2C)。而在第3天(P<0.05)和第7天(P<0.01)向小鼠尾静脉内注hDPSCs可以使小鼠肺脏干重降低，并显著降低小鼠肺脏指数(P<0.01， 图 2D)。

图 1 hDPSCs表面标志物表达

图 2 HE(A)， Masson(B)染色结果和小鼠肺脏重量(C、 D)

2.2 hDPSCs的处理抑制了BLM诱导的小鼠肺纤维化相关基因的表达

BLM处理促进ACTA2基因的表达(P<0.001)，而尾静脉注射hDPSCs则抑制(P<0.001)(图 3A)。相似的，在BLM诱导后第3天(P<0.05)和第7天(P<0.001)尾静脉注射hDPSCs也显著降低了在BLM诱导的肺组织中FN1的mRNA表达量(图 3B)。有趣的是，只有在第7天注射hDPSCs可以降低Col1a1的表达量(P<0.001)(图 3C)，而2 次注射对Col3a1的表达的抑制作用是相似的(P<0.001)(图 3D)。

图 3 hDPSCs中ACTA2， FN1， Col1a1， Col3a1的mRNA表达水平

2.3 hDPSCs的处理抑制了TGF-β1信号通路的激活

分析小鼠血清和肺脏内TGF-β1水平。如图 4A和 4B显示，BLM处理显著提高TGF-β1在小鼠血清和肺脏内的含量(P<0.001)，而hDPSCs的处理可以逆转这一过程。另一方面，hDPSCs尾静脉注射并不能调控TGF-β1的受体Smad2的表达(图 4C)。BLM刺激Vimentin高表达，而hDPSCs显著抑制了这一过程(图 4D)。BLM诱导E-cadherin低表达，而hDPSCs的处理促进了E-cadherin的表达量提高(图 4E)。

图 4 小鼠血清内和肺脏内TGF-β1含量和小鼠肺脏组织内Smad2， Vimentin， E-cadherin的mRNA表达水平

2.4 hDPSCs的处理抑制了Smad2/3的磷酸化

hDPSCs的尾静脉注射不能调控Smad2的表达。为了进一步探索hDPSCs是如何调控TGF-β1/Smad2/3信号通路的，用Western-blot实验检验了Smad2/3的磷酸化和其下游基因的表达量。与图3的结果一致，hDPSCs抑制了Vimentin的蛋白表达，并促进了E-cadherin的蛋白表达量(图 5A)。更重要的是，虽然hDPSCs并没有影响Smad2/3的蛋白表达总量，但是hDPSCs显著抑制了被BLM诱导升高的Smad2/3的磷酸化水平，而且第3天或第7天给予hDPSCs的尾静脉注射对于Smad2/3的磷酸化抑制作用并无显著差异(图 5A、 5B)。

图 5 小鼠肺组织中pSmad2/3， Smad2/3， Vimentin， E-cadherin的蛋白量水平(A)和Smad2/3的磷酸化水平(B)

3 讨 论

TGF-β在肺组织纤维化的发生和发展中是不可或缺的介质。多种因素可以导致TGF-β信号的激活，TGF-β分子与TGF-β受体(TGF-βR)相互作用并介导下游效应[10]。TGF-β促进上皮细胞发生以间充质特征为特征的表型转变。 此外，活跃的TGF-β信号传导在介导成肌纤维细胞活化以及随后产生胶原蛋白和其他细胞外基质成分中起着核心作用[11]。因此，靶向TGF-β信号通路并抑制肺泡上皮细胞的间质转化治疗是极有潜力的肺纤维化潜在疗法。

间充质干细胞已经被广泛应用于组织重建和疑难疾病治疗中[12]。大量研究显示，间充质干细胞治疗导致博来霉素诱导的动物肺中肺胶原沉积的改善和PF Ashcroft评分的改善，并显著改善组织肺病理学[13]。然而，无论是脐带，胎盘还是骨髓来源的间充质干细胞，都具有获取方法复杂，获取量受限等问题，这极大的限制了间充质干细胞在肺纤维化治疗中的应用[14]。

牙髓干细胞可以从生物废材中广泛获取。而在博莱霉素诱导的肺纤维化中，牙髓干细胞同样显示出了显著的治疗效果。本研究说明了尾静脉注射牙髓干细胞可通过抑制TGF-β1/Smad2/3 信号通路激活的肺泡上皮间质转化过程缓解小鼠肺纤维化，且在造模第3天或第7天时给予效果无显著区别。牙髓干细胞作为一种来源广泛，获取简单的间充质干细胞，能显著降低干细胞治疗成本，并成为一种潜在的肺纤维化治疗手段。