葛根素6″-O-木糖苷对ox-LDL诱导HUVECs细胞损伤的影响

袁向科， 江 瑞

(1.河南省中医院周围血管科，河南 郑州 450002；2.河南中医药大学第三附属医院老年病科，河南 郑州 450003)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的共同病理基础，可由高血压、高血糖、高血脂等多种因素引发，严重危害人类健康[1-2]。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)是早期动脉粥样硬化发生和发展的重要因素，其诱导的血管内皮损伤能促进泡沫细胞的形成，释放大量炎性反应因子，进而加重该病病程[3]。因此，减少ox-LDL诱导的内皮损伤是预防和治疗动脉粥样硬化的有效途径。

目前，黄酮类化合物因其抗炎、抗氧化等功能[4-5]在防治动脉粥样硬化方面受到广泛的关注[6-7]。葛根素6″-O-木糖苷是葛根中的主要异黄酮[8]，具有显著的抗肿瘤[9-10]、抗骨质疏松[11]活性，但该成分对血管内皮损伤的作用尚未见报道。因此，本研究采用ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)损伤，探讨葛根素6″-O-木糖苷对HUVECs活性、凋亡、炎性损伤及NF-κB信号通路的影响。

1 材料

HUVECs购自美国典型培养物保藏中心。DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；ox-LDL、维生素E购自美国Sigma公司。葛根素6″-O-木糖苷(纯度大于98%)购自上海同田生物科技有限公司。MTT试剂盒、IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒购自江苏凯基生物有限公司；caspase-3活性检测试剂盒、RIPA细胞裂解液、PMSF、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；cleaved caspase-3、ICAM1、VCAM1、p-p65、p-IκB-α、GAPDH等一抗购自英国Abcam公司和武汉博士德生物工程有限公司；二抗购自北京中衫金桥生物有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养、分组及给药 将HUVECs置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞生长至80%～90%时，用0.25%胰酶进行消化传代培养。将HUVECs随机分为6组，分别为对照组，正常培养48 h；ox-LDL组，正常培养基培养24 h后，100 μg/mL ox-LDL处理24 h；葛根素6″-O-木糖苷10、20、40 μmol/L组，10、20、40 μmol/L葛根素6″-O-木糖苷处理24 h后，100 μg/mL ox-LDL处理24 h；维生素E组，200 μg/L维生素E处理24 h后，100 μg/mL ox-LDL处理24 h。

2.2 MTT检测细胞活性 将细胞接种到96孔板上，按“2.1”项下方法处理，每孔加入10 μL MTT(0.5 mg/mL)，在37 ℃培养箱中孵育4 h，弃去培养基，每孔加入150 μL二甲基亚砜溶液，振荡15 min, 在490 nm波长处检测光密度(OD)值，计算细胞活性。

2.3 试剂盒检测细胞caspase-3活性 将细胞接种到6孔板上，按“2.1”项下方法处理，胰酶消化贴壁细胞，4 ℃离心5 min收集细胞，按caspase-3活性检测试剂盒说明书进行操作，在405 nm波长处检测OD值，计算caspase-3相对活性。

2.4 ELISA法检测细胞上清液IL-1β、TNF-α水平 按“2.1”项下方法处理细胞，离心收集细胞上清液，按ELISA试剂盒说明书检测IL-1β、TNF-α水平。

2.5 Western blot 检测细胞相关蛋白表达 将细胞接种到24孔板上，按“2.1”项下方法处理，每孔加入RIPA裂解液与PMSF的混合液(100∶1)裂解细胞15 min，离心收集上清，即为总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，取适量样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，采用半干转方法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗，在4 ℃下过夜孵育，再加入二抗，室温孵育1 h，采用红外激光成像系统扫描。以GAPDH为内参，分析蛋白相对表达。

3 结果

3.1 葛根素6″-O-木糖苷对ox-LDL诱导的HUVECs细胞活性的影响 如图1A所示，0、10、20、30、40 μmol/L葛根素6″-O-木糖苷处理HUVECs后，细胞活性无明显变化(P>0.05)，表明该成分无细胞毒性。如图1B所示，与对照组比较，ox-LDL可导致HUVECs的细胞活性下降(P<0.05)；与ox-LDL组比较，葛根素6″-O-木糖苷呈剂量依赖性地抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞活性下降(P<0.05)。

3.2 葛根素6″-O-木糖苷对ox-LDL诱导的HUVECs细胞caspase-3表达的影响 如图2A所示，与对照组比较，ox-LDL组细胞caspase-3活性升高(P<0.05)；与ox-LDL组比较，葛根素6″-O-木糖苷组呈剂量依赖性地抑制ox-LDL诱导的caspase-3活性升高(P<0.05)。如图2B所示，与对照组比较，ox-LDL组细胞cleaved caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)；与ox-LDL组比较，葛根素6″-O-木糖苷呈剂量依赖性地抑制ox-LDL诱导的cleaved caspase-3表达升高(P<0.05)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与ox-LDL组比较，#P<0.05。图2 各组HUVECs细胞caspase-3表达

3.3 葛根素6″-O-木糖苷对ox-LDL诱导的HUVECs细胞上清液中炎性因子的影响 如图3所示，与对照组比较，ox-LDL组细胞上清液中IL-1β(图3A)、TNF-α(图3B)水平升高(P<0.05)；与ox-LDL组比较，葛根素6″-O-木糖苷呈剂量依赖性地抑制ox-LDL诱导的IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与ox-LDL组比较，#P<0.05。图3 各组HUVECs细胞上清液中炎性因子水平

3.4 葛根素6″-O-木糖苷对ox-LDL诱导的HUVECs细胞中黏附分子的影响 如图4所示，与对照组比较，ox-LDL组细胞中ICAM1(图4A)、VCAM1(图4B)蛋白表达升高(P<0.05)；与ox-LDL组比较，葛根素6″-O-木糖苷呈剂量依赖性地抑制ox-LDL诱导的ICAM1、VCAM1表达升高(P<0.05)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与ox-LDL组比较，#P<0.05。图4 各组HUVECs细胞中黏附分子的表达

3.5 葛根素6″-O-木糖苷对ox-LDL诱导的HUVECs细胞NF-κB通路的影响 如图5A所示，与对照组比较，ox-LDL组细胞p-p65蛋白表达升高(P<0.05)；与ox-LDL组比较，葛根素6″-O-木糖苷呈剂量依赖性地抑制ox-LDL诱导的p-p65蛋白表达升高(P<0.05)。如图5B所示，与对照组比较，ox-LDL组细胞p-IκB-α表达升高(P<0.05)；与ox-LDL组比较，葛根素6″-O-木糖苷呈剂量依赖性地抑制ox-LDL诱导的p-IκB-α蛋白表达升高(P<0.05)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与ox-LDL组比较，#P<0.05。图5 各组HUVECs细胞NF-κB通路蛋白表达

4 讨论

血管内皮损伤是导致动脉粥样硬化发展的始动环节[12]，在该病病灶部位中ox-LDL水平升高。HUVEC具有与动脉血管内皮细胞相似的生物学特征，用ox-LDL体外诱导HUVECs，可以模拟体内血管内皮损伤。本研究发现，葛根素6″-O-木糖苷能够抵抗ox-LDL 诱导的HUVECs细胞损伤，提高细胞活性，抑制细胞凋亡和炎性反应。

在动脉粥样硬化斑块中存在广泛的内皮细胞凋亡，损伤的内皮细胞能够诱导IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子和VCAM1、ICAM1等黏附分子的产生，加速白细胞向内皮细胞的黏附和级联炎性反应[13]。通过ox-LDL诱导HUVECs，使得HUVEC细胞活性下降，caspase-3活性和表达提高，且IL-1β、TNF-α、VCAM1和ICAM1表达升高。Bhaskar等[14]发现槲皮素降低ox-LDL诱导的HUVECs中VCAM1、ICAM1、MCP-1和IL-6等炎性介质表达。槲皮素和芦丁调节JAK2通路抑制ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡[15]。芳香新塔花总黄酮抑制炎症反应来保护内皮细胞[16]。本研究中葛根素6″-O-木糖苷能够呈剂量依赖性地抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞损伤，包括提高细胞活性，降低caspase-3表达，且下调IL-1β、TNF-α、VCAM1和ICAM1表达。

NF-κB是一种重要的转录因子，广泛参与癌症、炎症和免疫疾病的发展[17-18]，其信号通路的激活与动脉粥样硬化的发展进程密切相关[19-21]。Bhaskar等[14]发现槲皮素通过调控NF-κB信号通路减少动脉粥样硬化炎性和黏附分子的表达。Deng等[22]发现葛根素通过抑制NF-κB信号通路可抵抗LPS诱导的血管内皮损伤。本研究发现ox-LDL处理导致HUVECs细胞中p-p65和p-IκB-α表达升高，激活NF-κB信号通路；而葛根素6″-O-木糖苷处理能够呈剂量依赖性地抑制ox-LDL诱导的p-p65和p-IκB-α表达升高。

综上所述，本研究证实了葛根素6″-O-木糖苷在ox-LDL诱导的HUVECs细胞中发挥重要的作用，包括提高细胞活性，抑制细胞凋亡，降低炎性因子和黏附分子水平，与抑制NF-κB信号通路有关。