GC-MS/MS法同时测定蜂王浆中8种高风险农药残留

王健，黄华，方建军*，郭浩炜，段瑀，毛小红

衢州市食品药品检验研究院（衢州 324000）；2. 浙江江山健康蜂业有限公司（江山 324100）

蜂王浆也叫蜂乳，简称王浆。是工蜂头部营养腺分泌的一种乳白色或淡黄色、略带甜味并附有酸涩味的浆液[1]，富含氨基酸、糖类、有机酸等多种活性成分[2]，具有抑菌、抗氧化、抗衰老及护肤美容等其他多方面生理作用，被誉为“生命青春之源”[3]。中国是蜂王浆生产和出口第一大国，世界上90%以上的蜂王浆产自中国[4]，2019年，日本、欧盟对蜂王浆农药残留限量要求提高，中国需要研究突破日本、欧盟技术壁垒的农药残留检测的法定标准，从而解决农药残留问题[5]。以日本为例，进口蜂王浆需检测氟胺氰菊酯等高风险农药残留。因此，亟须从国际出发，提升检测方法，破解技术壁垒。

农药残留的检测方法主要有气相色谱（GC）法[6-7]、高效液相色谱（HPLC）法[8-9]、气相色谱-质谱（GCMS）法[10-11]、液相色谱-质谱（LC-MS）法[12-13]。这些检测方法在一定程度上增强了对蜂王浆中农药残留的质控力度，但是方法涉及的品种偏少，类别单一，前处理过程和检测手段不同且繁琐，现行标准如GB 23200.98—2016《食品安全国家标准 蜂王浆中11种有机磷农药残留量的测定 气相色谱法》和GB 23200.100—2016《食品安全国家标准蜂王浆中多种菊酯类农药残留量的测定气相色谱法》采用气相法，存在灵敏度偏低和假阳性干扰。采用GC-MS/MS法建立一种科学、简单、快捷、准确的检测方法，可填补国内蜂王浆中多种高风险农药残留量检测方法的空白。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 仪器与设备

8890-7000D气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（安捷伦公司）；XS-205电子天平（瑞士梅特勒公司）；Milli-Q超纯水仪（美国密理博公司）；X1R冷冻离心机（美国赛默飞公司）。

1.1.2 标准品

双甲脒（CAS 33089-61-1，批号G1037847，纯度99.2%）、双甲脒2,4-DMA（CAS 95-68-1，批号G147027，纯度99.38%）、氯苯胺灵（CAS 101-21-3，批号G167711，纯度99.70%）、克螨特（CAS 2312-35-8，批号G140573，纯度99.55%）、毒死蜱（CAS 2921-88-2，批号G989695，纯度99.61%）、三唑醇（CAS 55219-65-3，批号G163571，纯度98.91%）、蝇毒磷（CAS 56-72-4，批号G141883，纯度99.15%）、氟胺氰菊酯（CAS 102851-06-9，批号G1005521，纯度97.30%），均为德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.1.3 试剂和供试品

检测用样品（浙江江山健康蜂业有限公司）；乙腈（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；其他化学试剂（均为分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；自制超纯水。

1.2 方法

1.2.1 标准品溶液的制备

精密称取8种标准品各约20 mg，分别置于10 mL量瓶中，以乙腈为溶剂定容至刻度，摇匀，即得每1 mL各含2 mg标准品储备液，精密吸取各标准品储备液适量混合，使用空白基质提取液逐级稀释储备液，配制成0.02，0.05，0.10，0.15，0.20和0.25 μg/mL的混合标准溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备

称取2 g（精确至0.01 g）试样于50 mL塑料离心管中，加入10 mL水涡旋混匀，加入300 μL氨水，涡旋混匀，加入乙腈-三氯甲烷（1∶1，V/V）溶液10 mL，涡旋5 min，使试样完全乳化溶解，无颗粒物，加入10 g无水硫酸钠，剧烈振荡3～5 min后以6000 r/min离心5 min，吸取上清液，残渣中加入5 mL乙腈，剧烈振荡3 min后以6000 r/min离心5 min，合并上清液，加入5 mL正丙醇，40 ℃水浴中氮气吹干，加入1 mL乙腈复溶，过0.22 μm滤膜，用于测定。

1.2.3 仪器色谱条件

色谱柱Agilent 19091S-431 HP-5ms，15 m×250 μm×0.25 μm 2根；色谱柱温度60 ℃保持1 min，以40 ℃/min的升温速率升至120 min，以5 ℃/min的升温速率升至310 ℃；载气为氦气，纯度≥99.999%，流速1为0.866 mL/min，流速2为1.066 mL/min；进样口温度280 ℃；样量1 μL；电子轰击源70 eV；离子源温度280 ℃；传输线温度280 ℃；溶剂延迟4 min；8种农药残留其他质谱条件参数见表1。

表1 8种农药残留保留时间、定量离子对、定性离子对、碰撞电压

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

色谱柱采用Agilent 19091S-431 HP-5ms，15 m×250 μm×0.25 μm 2根，试验采用反吹装置将2根色谱柱串联起来，该装置作用是每一针进样完成后在中间会用载气进行反吹，将残留污染物尽可能去除，经过反吹可使仪器、色谱柱、离子源等部位减少残留，提高仪器、色谱柱、离子源等使用寿命。在EI离子源的模式下，用MS2全扫描类型，将0.25 μg/mL的标液进行SCAN扫描，得到色谱图（见图1～图4），确定各组分的保留时间。采用Agilent MassHunter TQ优化程序优化前级离子、产物离子、碰撞能量等参数，选择灵敏度高、稳定性和重现性好的离子作为定量离子。8种农药残留的定量离子对、定性离子对、碰撞能量及保留时间见表1。

图1 2, 4-DMA和毒死蜱色谱图

图2 氟胺氰菊酯和克螨特色谱图

图3 氯苯胺灵和三唑醇色谱图

图4 双甲脒和蝇毒磷色谱图

2.2 检测方法学验证

2.2.1 检出限和标准曲线

在1.2.3的试验条件下，以空白蜂王浆为基质提取液配制的系列农药标准质量浓度分别为0.02，0.05，0.10，0.15，0.20和0.25 μg/mL的混合标准溶液，供气相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定。以农药定量离子峰面积为纵坐标、农药标准溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果表明：8种农药残留在0.02～0.25 μg/mL具有良好线性关系，相关系数R2为0.991 7～ 0.999 0；根据检测时的信噪比（S/N）3和信噪比（S/N）10时分别计算8种农药残留的检出限和定量限，该方法检出限为0.003 mg/kg，定量限为0.009 mg/kg，能够很好满足定量分析要求（见表2）。

表2 8种农药残留检出限、定量限、相关系数

2.2.2 回收率和精密度

称取蜂王浆空白样品进行0.01，0.05和0.10 mg/kg 3个浓度水平添加回收率试验，每个浓度水平平行进行3次试验，在每个添加浓度水平选取其中1份重复测定6次进行精密度试验。在1.2.3试验条件下，结果显示8种农药残留在3个浓度回收率为80.7%～109.2%，精密度SRSD（n=6）为0.89%～9.74%。8种农药残留回收率和精密度SRSD见表3。

表3 8种农药回收率、精密度、准确度

2.2.3 准确度试验

在1.2.3试验条件下，以添加回收率的方式添加质量分数0.05 mg/kg水平进行3次试验，对测定含量（经回收率校正后）平均值与真值含量进行偏差比较，GB/T27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F.5中规定在0.05 mg/kg添加质量分数下偏差范围为-20%～10%，结果表明该方法准确度好（见表3）。

3 结论

建立气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（GC/MS/MS）检测蜂王浆中8种农药残留的最优检验方法。通过试验验证，8种农药残留线性关系良好，相关系数R2为0.9917～0.9990，回收率为80.7%～109.2%，相对标准偏差为0.89%～9.74%（n=6），准确度在-10.1%～ 5.6%，检出限为0.003 mg/kg。该方法具有检出限低、灵敏度高、简单、快捷、准确的特点，可为相关检测机构、蜂王浆生产企业及出口企业提供方法参考。