蛇足石杉孢子离体繁殖技术研究

毛晓怡，杨 鑫，刘 锐，建德锋

（吉林农业科技学院 吉林，吉林 132101）

蛇足石杉（），又名蛇足石松，为石杉科中的一种多年生草本植物，该植物为阴生蕨类植物，全草均可入药，入药具有消肿止痛、止血散瘀、清热除湿等功效，还可以治跌打损伤、内伤吐血、烫火伤等症。随着蛇足石杉在药用方面的需求量日益增大,野生资源又极其匮乏,而人工繁殖起来又很不易，导致市场上蛇足石杉药材稀缺。为此，加速蛇石足杉苗木的培育非常关键，为给其快速繁殖提供参考依据,该试验以蛇足石杉的孢子为原材料，研究其离体繁殖技术。

1 材料和方法

1.1 实验时间及地点

试验于2020年6月份开始进行，2021年3月份结束，试验于吉林农业科技学院北校区组培实验室进行。

1.2 材料处理

从野外采挖蛇足石杉植株，带土栽植入花盆中，放入室内进行重点养护。接种前采集母株上的孢子叶，在0.1%的升汞（HgCL）溶液中浸泡3 min，再用无菌水冲洗4-5次，沥干水分，带入接种室中，放在超净台下分三种方式进行接种，分别为：A1.将1cm大小的孢子叶直接接到培养基上；A2.把孢子囊从孢子叶上分离后接种；A3.将孢子囊分离后，放在小块滤纸上（2cm大小），压碎取出孢子，连同滤纸一起接种。

1.3 培养基配方

培养基均以MS作为基本培养基，添加糖30g/L，琼脂7g/L。具体各个阶段的配方见表1。

2 结果和分析

2.1 孢子体不同接种方式对诱导萌发的影响

外植体以3种不同放置方式接种到6种培养基上，每瓶接1块原材料，每种培养基接30瓶，每种方式180瓶，共接540 瓶。接种后统计成活数量、污染数量、出现愈伤组织数量，计算出愈率；后期统计不定芽出现时间、芽成活瓶数，计算萌发率，具体如表2。由表2 可以得出，3 种接种方式污染瓶数都比较多，这是因为初次接种外植体来自于室外；3种接种方式都能产生愈伤组织，但A1萌发成活瓶数及萌发率显著高于A2和A3。

2.2 不同诱导培养基对诱导萌芽的影响

表1 各阶段培养基配方

表2 外植体3种处理方法萌发情况

表3 不同诱导培养基对诱导萌芽的影响

表4 不同增殖培养基上增殖情况

表5 不同生根培养基中生根情况

在6 种不同诱导培养基上用A1 的接种方式进行接种，每瓶培养基接1块外植体，共接300瓶，观察愈伤组织形成芽的情况，计算芽萌发率，见表3。由表3可知，成活瓶中外植体也都诱导出了愈伤组织，这就说明配方中6-BA和NAA的选择是正确的，一段时间后，愈伤组织能萌发出不定芽，但各自的萌发状况不同，这说明激素的浓度对诱导萌发有影响，但B3、B4 这两种培养基配方的萌发率较高，B5、B6、B2、B1相对较低，综合比较得出MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L配方最好。

2.3 不同增殖培养基上增殖情况

待诱导阶段萌发出的不定芽长成3-4 cm 高时，将其切成1-2 cm 小段转接到7 种不同增殖培养基配方中，各小段开始生长，转瓶28 d统计各瓶中苗木的增殖状况，具体结果见表4。由表4可以看出，C6增值倍数最大，C5平均苗高最大；从C1-C6玻璃化的比率一直处于上升状态，说明NAA 添加容易导致玻璃化。经查阅资料显示，在培养基中添加1.0 mg/L的GA，可以减少玻璃化现象。因此在第2次继代时，选择在C5、C6配方添加1.0 mg/L GA，发现C5配方添加后已无玻璃化现象发生，而C6配方仍有玻璃化存在。最终得出C5+GA1.0mg/L最适合作为增殖培养基配方。

2.4 不同生根培养基上生根情况

表5 是不同生根培养基配方中生根情况的数据。由表5 可以看出，D1 和D2 的生根率最高，并且达到了100%，而D3 与D4 的生根率只有72%和23%。通过比较D1 和D2 的其他因素，综合得出D2 更适合蛇足石杉生根生长。

3 结论与讨论

诱导阶段得出A1 为最佳接种方式。采用A1 这种接种方式进行接种，观察在不同诱导培养基中的茎段的诱导分化情况，从而得出最佳的初代培养基配方为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，最佳的增殖培养基配方为MS+KT 1.0mg/L+NAA 0.2 mg/L+ GA3 1.0mg/L，最佳的生根培养基配方为1/2 MS+IBA 0.5 mg/L。6-BA 和NAA 为植物组织培养中非常常见的生长素，主要作用是诱导细胞分裂和根的分化，这两种激素一起使用可以诱导蛇足石杉产生愈伤组织并萌发，但是它们的作用浓度有一定的范围，浓度超过这个范围就会产生抑制作用，所以该试验诱导阶段选用浓度配方MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L具有一定的实践意义。