液氮冻融联合胰蛋白酶消化脱细胞法构建猪心脏瓣膜支架的研究

崔勇 梅富杨 胡志斌 葛根贤 孙高忠

心脏瓣膜病是我国常见的成人心脏病，瓣膜置换手术是目前主要的治疗方法。目前临床上应用的人造心脏瓣膜主要有机械瓣和生物瓣两大类，均能有效改善血流动力学，但又各有缺陷。机械瓣置换后患者需终身抗凝，因抗凝不当而造成的出血和血栓栓塞是影响患者长期存活的重要因素，而生物瓣置换后一般15年左右会发生衰败，需要再次更换[1-2]。随着生物技术的发展，组织工程心脏瓣膜（tissue engineered heart valve,TEHV）有望解决上述问题[3-4]。TEHV的研制涉及瓣膜支架的制备、种子细胞的选择、细胞种植与体外预适应等过程。瓣膜支架的制备是TEHV研究的核心内容之一，理想的生物材料支架需具备生物相容性、抗钙化及细胞亲和性等条件[5-6]。脱细胞瓣膜是将同种异体或者异种心脏瓣膜作为TEHV的支架材料，具有瓣膜形态和结构完整、生物相容性好、利于内皮细胞黏附和生长等优点[7-8]。本研究通过液氮冻融联合胰蛋白酶消化的方法，对猪心脏瓣膜进行脱细胞处理，期望获得无免疫原性、结构完整、有抗钙化潜能的去细胞瓣膜，为TEHV研制提供合适的支架材料。

1 材料和方法

1.1 材料和分组 成年猪（由浙江省桐乡市濮院国联商业有限公司屠宰场提供）宰杀后即刻（热缺血时间10 min以内）在清洁条件下取出主动脉瓣膜，肉眼检查瓣膜质量，留取外观正常的瓣叶，无菌操作下剪成约1 cm×1 cm的小块，经PBS冲洗后置入液氮罐中带回实验室处理。将猪心脏瓣膜小块按随机数字表法分为实验组、对照组和未处理组，平均每组设置5个重复标本。

1.2 方法

1.2.1 猪心脏瓣膜标本的处理 将标本予5次液氮冻融，每次3 min；经PBS清洗后，实验组标本浸入0.6%胰蛋白酶溶液，37℃摇床，消化3 d；再经PBS清洗后浸入5%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）（批号：A100227，上海生工生物工程股份有限公司）溶液中，40℃，3 d。对照组标本经液氮冻融后浸入5%SDS溶液中，37℃，6 d。未处理组通过液氮冻融后，浸入无菌0.9%氯化钠溶液中，常温，6 d。

1.2.2 瓣膜组织大体结构和细胞成分变化观察 将3组猪心脏瓣膜组织标本浸入4%多聚甲醛溶液（批号：P0099，上海碧云天生物技术有限公司）中固定12 h，经石蜡包埋、组织切片和脱蜡，经HE（批号：C0105S，上海碧云天生物技术有限公司）染色后，用中性树脂封片，显微镜下观察。

1.2.3 瓣膜组织胶原纤维结构观察 将上述脱蜡后的组织切片，经维多利亚蓝（Victoria blue,VB）染液、丽春红-苦味酸染液（批号：A600985，上海生工生物工程股份有限公司）染色后用中性树脂封片，显微镜下观察。

1.2.4 瓣膜组织残留DNA含量检测 将脱细胞的猪心脏瓣膜标本真空抽干后，经液氮研磨成粉末，取20 mg，利用 DNA提取试剂盒（批号：9765，日本 TaKaRa公司）提取DNA，利用紫外分光光度计检测残留DNA含量。

1.2.5 瓣膜组织α-Gal抗原残留检测 采用Western blot法。将上述的组织粉末，按100 mg组织加入30 μl RIPA溶液（批号：P0013C，上海碧云天生物技术有限公司）提取组织蛋白，离心后经BCA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，P0010C）测定蛋白浓度。以30 μg蛋白作为上样量，经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后，加入 1∶1 000稀释的 α-Gal一抗（批号：A01135-2，武汉博士德生物技术有限公司），4℃孵育过夜；再经1∶5 000稀释的二抗室温下孵育1 h；清洗后显影。免疫印迹条带的灰度值使用Image J软件分析，并以上样蛋白量为参照计算相对灰度值。

1.2.6 瓣膜组织抗钙化潜能观察 将脱蜡复水的组织切片，加入茜素红染色液（批号：ST1078，上海碧云天生物技术有限公司）浸染5～10 min；蒸馏水充分洗涤；经常规水化透明后用中性树脂封片，显微镜下观察。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件，符合正态分布的计量资料以 表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组猪心脏瓣膜组织大体结构和细胞成分比较实验组瓣膜组织无明显的细胞残留[（3.8±1.3）%]，而对照组仍有少量细胞残留[（17.8±3.7）%]，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；未处理组可见大量的细胞残留，见图 1（插页）。

图1 3组猪心脏瓣膜组织大体结构和细胞成分比较（a：猪心脏瓣膜组织的大体结构，HE染色，×200；b：3组心脏瓣膜组织细胞残留率比较，**P＜0.01）

2.2 3组猪心脏瓣膜组织胶原纤维结构观察 实验组胶原纤维结构完整，纤维束排列整齐，未见明显破坏和断裂；对照组胶原纤维也未受到明显破坏，但组织略显疏松，见图2（插页）。

图2 3组猪心脏瓣膜组织胶原纤维结构观察（丽春红-苦味酸染色，×200）

2.3 3组猪心脏瓣膜组织残留DNA含量比较 脱细胞处理后，实验组瓣膜组织残留DNA含量为（55.6±16.8）μg/g，对照组瓣膜组织残留DNA含量为（750.4±178.1）μg/g，两组瓣膜组织残留DNA含量均显著低于未处理组的（7 563.1±1 169.3）μg/g（均 P＜0.01），见图 3。

图3 3组猪心脏瓣膜组织残留DNA含量比较

2.4 3组猪心脏瓣膜组织残留α-Gal抗原比较 与未处理组（0.61±0.07）相比，实验组无明显的α-Gal抗原残留（0.02±0.01），而对照组仍有少量 α-Gal抗原残留（0.14±0.02），后两组的抗原残留均低于未处理组（均 P＜0.01），见图 4。

图4 3组猪心脏瓣膜组织残留α-Gal抗原比较（a：3组标本的α-Gal电泳图；b：相对灰度值的比较，**P＜0.01）

2.5 3组猪心脏瓣膜组织抗钙化潜能比较 大鼠皮下包埋2周后，实验组出现轻微钙化结节，平均结节数为（44±12）个/mm2；而对照组钙化结节较多，平均结节数为（157±21）个/mm2。两组钙化结节数量均低于未处理组的（697±165）个/mm2（均P＜0.01），见图5（插页）。

图5 3组猪心脏瓣膜组织抗钙化潜能比较（a：3组猪心脏瓣膜组织的茜素红染色所见，×200；b：单位面积的钙化结节数比较，**P＜0.01）

3 讨论

经典的TEHV构建方法是按照组织工程学原理，先构建具有心脏瓣膜形态的支架，然后在支架上种植自体活细胞，细胞在支架上生长并逐渐对原来的支架进行改建，最终形成完全由自体细胞和基质所构成的瓣膜组织。目前组织工程瓣膜的发展尚需克服当前建模材料的临床应用局限性，才有可能彻底改变瓣膜置换手术的现状[9-10]。由于异种移植物具有几乎无限的可用性，因此可以作为理想的供体组织类型[4]。本研究采用猪心脏瓣膜为研究对象，通过对脱细胞瓣膜的结构完整性、免疫原性及抗钙化等分析，明确了其作为TEHV支架材料的可行性和潜在优势。

支架材料为种子细胞提供一个生长、发育、分泌细胞外基质及发挥其他功能的生物学空间，同时也为邻近细胞迁移、生长、分化提供良好的微环境，为TEHV构建提供了细胞载体与组织结构平台。良好的细胞外支架应具备生物相容性良好、表面活性利于细胞黏附与增殖、适宜的生物降解性、力学性能好等优点[11-12]。前期研究证实，乙酸和胶原酶方案尽管能分离出基质成分，但会破坏机械性能[13]。真空冷冻干燥是提高脱细胞材料支架孔隙率的方法，但一些研究发现真空冷冻干燥会导致胶原蛋白破裂，组织机械性能有所下降[14-15]。本研究中采用液氮冻融联合胰蛋白酶消化和SDS的方法，既有效清除了细胞及DNA残留，又保证了组织结构的完整性，是瓣膜材料的优化脱细胞方法。

成熟TEHV的构建需要脱细胞基质框架支持种植细胞的生长黏附。研究证实骨髓间充质干细胞是目前TEHV再细胞化的首选细胞群，但种植后细胞生长会出现极性缺失、排列松散、黏附力较低等问题[16-17]。因此，在脱细胞去除免疫原性的同时，不破坏基质细胞生长黏附的性能显得尤为重要。目前，各种类型的涂层具备良好的细胞生长特性，显著提升脱细胞支架的细胞附着性能，如PHBHHx涂层[18]、钛基表面纳米银复合涂层[19]、Galectin-8[20]等。本研究中采用液氮冻融联合胰蛋白酶消化和SDS的方法，在基质完整性保持方面具有较好的效果，但对于种植细胞的黏附生长等方面的特性还需进一步研究，为生物材料的组织工程瓣膜发展提供实验数据。

本研究采用液氮冻融联合胰蛋白酶消化对猪心脏瓣膜进行脱细胞处理，可有效去除残余细胞成分，降低免疫排斥反应；保留基质结构完整性，维持天然的组织结构和功能；具有一定的抗钙化效果，延长生物材料的潜在使用期。运用该方法获得的脱细胞猪心脏瓣膜，可作为TEHV的优质支架材料。