过表达LncRNA IFNG-AS1急性淋巴细胞白血病细胞株的定量蛋白质组学分析

吴 珊，蒋 丹，徐广贤

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；2.广东医科大学医学技术学院医学检验系，东莞 523000）

急性淋巴细胞白血病（ALL）起源于淋巴祖细胞在骨髓、血液和髓外部位的恶性转化和异常增殖，5年的总存活率为45%～90%。ALL的发病率呈双峰分布，第一个高峰发生在儿童时期，第二个高峰发生在50岁左右[1]。尽管诱导化疗的反应率很高，但只有30%～40%的成年ALL患者能实现缓解。长链非编码RNA（LncRNA）IFNG-AS1，又称TMEVPG1或NeST，最初发现是由于小鼠对Theiler病毒反应差异[2]。研究[3]表明，IFNG-AS1调控IFN-γ表达，以及调控Theiler病毒和沙门氏菌的应答。同时，IFNG-AS1在免疫性疾病和肿瘤中高表达，如垂体腺瘤、炎症性肠病、类风湿关节炎、乳腺癌和宫颈癌等。然而，关于IFNG-AS1在ALL中的机制作用研究较少。本研究通过构建IFNG-AS1过表达细胞系，以验证IFNG-AS1过表达的体外效果，以期为ALL发病机制中涉及的靶点提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

急性淋巴细胞白血病jurkat T细胞株源于本实验室保存。RPMI 1640培养基（01-100-1A）和胎牛血清FBS（04-001-1A）购于美国Biological Industries公司；TMT Mass Tagging Kits（90064B）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622）和SYBR Green qPCR Supermix（11733046）均购于美国Thermo Fisher Scientific公司；碘乙酰胺（IAA，144-48-9）、二硫苏糖醇（DTT，16096-97-2）、尿素（57-13-6）、乙二胺四乙酸（EDTA，60-00-4）和硼氢化四乙基铵（TEAB，17083-85-1）均购于美国Sigma公司；可表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒购于北京合生基因公司。

1.2 细胞系、细胞培养和慢病毒侵染

将jurkat T细胞株置入含5%胎牛血清和1%青霉素/链霉素1640培养基中培养细胞（37℃，5%CO2）。慢病毒侵染jurkat细胞后通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证病毒侵染效率。

1.3 qRT-PCR检测

从IFNG-AS1过表达慢病毒侵染的jurkat细胞中使用TRIzol试剂提取总RNA。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链。SYBR Green qPCR Supermix进行qRT-PCR。使用2-ΔΔCT模式对所有数据进行量化。GAPDH作为内参，所有实验均重复3次。

1.4 蛋白质提取、胰蛋白酶消化和TMT标记

用高强度超声粉碎仪在冰上（8 mol·L-1尿素，1%蛋白酶抑制剂，2 mmol·L-1EDTA）对jurkat细胞进行3次超声粉碎（每次4～6 s）。取剩余细胞碎片，4℃12 000×g离心10 min后收集上清，根据BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度。消化时，用5 mmol·L-1DTT 56℃，30 min还原蛋白溶液，接着通过11 mmol·L-1IAA室温暗室孵育15 min。稀释蛋白质样品直至尿素浓度低于2 mol·L-1。胰蛋白酶37℃消化过夜，Strata X C18 SPE柱去除多肽后进行真空干燥。

1.5 高效液相色谱（HPLC）分离

采用反相高效液相色谱柱（Agilent 300 Extend C18）（5μm颗粒，4.6 mm内长，250 mm全长）分离胰蛋白酶肽。首先用8%～32%的乙腈（pH 9.0）梯度在60 min内将多肽分成60个馏分。而后组合多肽成9个馏分，真空离心干燥。

1.6 液相色谱-质谱（LC-MS/MS）分析

多肽溶解在（0.1%甲酸和2%乙腈）溶剂A中，使用EASY-nLC 1000系统进行分离。（0.1%甲酸和90%乙腈）溶剂B液相梯度设置为:0～30 min：8%～16%B；30～55 min：16%～30%B；55～57 min：30%～80%B；57～60 min：80%B，流速恒定为400 nL·min-1。使用超高效液相色谱（UPLC）分离肽段，并置于纳米电喷雾离子源（NSI），然后在Orbitrap Fusion Lumos系统（Thermo Fisher Scientific，美国）进行质谱分析（MS）。电喷雾电压为2.0 kV，利用高分辨率的Orbitrap检测并分析肽前体离子和次级片段。对于分辨率为60 000的MS扫描，m/z扫描范围为350～1 550，MS/MS扫描范围固定起始点100 m/z，分辨率为15 000。

1.7 质谱数据处理

MS/MS数据使用Maxquant搜索引擎进行处理。蛋白质组分析，串联质谱在SwissProt Human数据库（包含20 317条序列）中搜索。通过增加常见污染物数据库消除蛋白质污染对鉴定结果的影响。胰酶/P被指定为一种切割酶，最多允许有2个缺失切割。第一次搜索中前驱体离子的质量容差为20 ppm，主搜索中是5 ppm，片段离子质量容差是0.02 Da。Cys的烷基化修饰选择固定修饰，Met的氧化和N端乙酰化修饰选择可变修饰。定量方法设置为TMT-6plex，用于蛋白质鉴定的误检率（FDR）和肽谱匹配（PSM）的阈值均低于1%。

1.8 生物信息学分析

通过UniProt-GOA数据库对蛋白质组进行基因本体论（GO）注释，采用InterProScan软件将所有未被该数据库标注的蛋白质进行序列比对GO注释。GO注释将蛋白质分为生物过程、细胞成分和分子功能三大类。运用WoLF PSORT软件预测亚细胞定位，KEGG数据库进行蛋白质通路注释。鉴定蛋白的功能富集分析应用Perl module进行Fisher精确检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鉴定jurkat T细胞中IFNG-AS1的表达

提取过表达IFNG-AS1的jurkat细胞总RNA，验证慢病毒侵染效率。荧光倒置显微镜结果显示，镜下观察到大量绿色荧光斑点，说明IFNG-AS1慢病毒侵染效率较高。qRT-PCR结果显示，过表达IFNG-AS1组的jurkat细胞组表达量较空载体组增加约395倍（P＜0.001）。说明IFNGAS1过表达成功，且效率较高（图1）。

图1 过表达LncRNA IFNG-AS1的jurkat细胞系

2.2 过表达IFNG-AS1对jurkat细胞蛋白质组学的影响

利用LC-MS/MS分析jurkat细胞中IFNGAS1过表达后蛋白质表达的变化，共鉴定出429个差异表达蛋白（DEPs），其中188个下调，241个上调。共获得402 574个二级光谱，鉴定出6 984个蛋白质。质谱分析鉴定了50 099个肽，包括47 898个特异性肽（图2A）。本结果鉴定的相对分子质量为10～100 kDa的蛋白质数量最多（图2B）。肽段大部分分布在7～20个氨基酸，符合碎裂方式基于trypsin酶解和HCD的一般规律（图2C），具有两个以上的肽段（图2D）。绝大多数谱图符合轨道阱质谱的高精度特性，一级质量误差在10 ppm以内（图2E）。在样本的蛋白定量主成分分析（PCA）结果中，重复样本之间的聚集程度越好代表重复性越好。各重复样本间蛋白质定量值相对标准差（RSD）箱线图中，整体RSD值越小，定量重复性越好。结果显示过表达IFNG-AS1的jurkat细胞组和空载体组的RSD＜0.2，即两组蛋白定量重复性较好（图3）。

图2 IFNG-AS1过表达jurkat细胞表达改变的蛋白

图3 重复实验样本一致性检验

2.3 定量蛋白质组学对过表达LncRNA IFNGAS1的jurkat细胞的差异蛋白筛选

通过定量蛋白质组学对LncRNA IFNG-AS1改变的jurkat细胞中的DEPs进行分析，细胞中有141个蛋白表达发生了显著变化（至少增加1.5倍或减少0.67倍，P＜0.05），其中91个蛋白表达上调，50个蛋白表达下调（图4）。

图4 jurkat细胞中IFNG-AS1调控蛋白的定量蛋白质组学鉴定

2.4 DEPs的功能分类与注释

通过亚细胞定位分析、同源群/真核同源群（COG/KOG）功能分类和GO分析来评价这141个DEPs的生物学功能。亚细胞定位分析显示，DEPs广泛分布于细胞核、细胞质、胞外间隙和细胞质膜（图5A）。COG/KOG分类表明，前5种功能分别为信号转导机制、转录、细胞骨架、翻译后修饰、脂质转运和代谢（图5B）。GO分析注释将这141个蛋白质分为3类，即生物过程、细胞成分和分子功能（图5C）。

图5 过表达IFNG-AS1的jurkat细胞DEPs的亚细胞定位、COG/KOG、GO分析的分类和注释

2.5 过表达IFNG-AS1的jurkat细胞中相互作用蛋白的功能富集分析

利用GO富集的聚类分析方法，比较过表达IFNG-AS1的细胞中差异蛋白功能的相关性。生物过程分析结果表明，上调的蛋白与细胞表面受体信号通路和中性粒细胞免疫调节有关，下调的蛋白与细胞分裂、脂质生物合成有关（图6A、图6B）。细胞成分分析结果表明，上调的蛋白与细胞质膜和分泌颗粒相关，下调的蛋白与染色体相关（图6C、图6D）。分子功能结果显示，上调的蛋白与肌动蛋白结合有关，下调的蛋白与DNA作用有关（图6E、图6F）。此外，KEGG通路分析表明，这141个DEPs在一些基本的生物通路中发挥作用，包括PPAR信号通路、T细胞受体信号通路和PI3K/Akt信号通路（图7）。

图6 jurkat细胞过表达LncRNA IFNG-AS1后DEPs的GO富集分析

图7 jurkat细胞过表达LncRNA IFNG-AS1后DEPs的KEGG富集分析

2.6 qRT-PCR验证过表达LncRNA IFNG-AS1的jurkat细胞中差异蛋白表达

为验证基因水平的变化是否与蛋白质水平一致，对所选的蛋白质进行qRT-PCR验证。选择LIM结构域蛋白2（LIMD2）、纤维鞘相互作用蛋白2（FSIP2）、肌糖原磷酸化酶（PYGM）、管蛋白-酪氨酸连接酶样蛋白1（TTLL1）、姐妹染色单体内聚蛋白2（ESCO2）、DNA甲基化转移酶3B（DNMT3B）、内质网钙ATP酶1（ATP2A1）进行qRT-PCR验证，结果显示LIMD2、FSIP2、PYGM、TTLL1、ESCO2、DNMT3B、ATP2A1的相对基因表达水平与蛋白表达水平一致（图8）。

图8 qRT-PCR验证过表达LncRNA IFNG-AS1的jurkat细胞中差异蛋白变化

3 讨论

研究[4]表明，LncRNA IFNG-AS1在人类免疫性疾病和肿瘤的发生发展中发挥重要作用。本研究利用定量蛋白质组学、生物化学分析和生物信息学分析，系统地描述了LncRNA IFNG-AS1过表达对jurkat细胞的整体蛋白质组谱的影响，以此筛选LncRNA的潜在调控靶点。实验结果表明，共141个蛋白在IFNG-AS1过表达jurkat细胞中差异表达。生物信息学分析表明，许多DEPs在生物过程、细胞成分、分子功能、亚细胞定位和信号通路中发挥作用。GO和KEGG通路富集分析表明，本实验所鉴定的DEPs在几个基本的分子功能和生物调控通路中富集。亚细胞定位分析表明，DEPs主要分布在细胞质和细胞核中。GO分析表明，这些DEPs与细胞分裂和免疫调节相关，具有催化活性和离子结合功能。KEGG通路分析表明，DEPs参与了多种重要的信号通路（PPAR信号通路和PI3K/AKt信号通路）、代谢通路、DNA复制的调控。LncRNA IFNG-AS1通过激活这些信号通路，可以判断出LncRNA在jurkat细胞的几个重要病理反应中的作用，包括迁移、侵袭和增殖。此外，通过定量蛋白质组学数据的深度挖掘，以及qRT-PCR检测，最终确定了7个表达显著的差异蛋白。

ESCO2是一种姐妹染色单体内聚蛋白，通过与MCM复制解旋酶的相互作用促进内聚[5]。依据KEGG结果可得，ESCO2参与了mTOR信号通路的调节。现有研究[6]表明，ESCO2通过活化AMPKα抑制mTOR的激活，进而降低S6K1的磷酸化水平并抑制RPS6的激活，导致细胞生长能力减弱。差异蛋白PYGM与糖原代谢有关，已被证实在乳腺癌中下调，其表达与患者生存时间相关[7]。先前的研究表明糖原代谢可能在癌症进展中起着重要作用[8]。与正常组织相比，实体瘤中糖原含量较高，糖原的正确储存和管理可能与肿瘤细胞的生存有关[9-12]，提示PYGM在肿瘤中可能具有调节作用。LIMD2是一种在转移性肿瘤中过度表达的小型LIM-only蛋白，通过直接结合和激活整合素连接激酶来调节细胞运动和肿瘤进展[13]。FSIP2可作为肾细胞癌透明细胞预后的预测生物标志[14]。ATP2A1表达在乳腺癌患者中高度改变[15]。TTLL1在细胞重组过程中在Glu381位点上对Klf4进行聚谷氨酰胺化，阻碍了其赖氨酸48连锁泛素化，维持了Klf4的稳定性，而Klf4聚谷氨酰基化在调节细胞重编程和多能性维持中发挥着关键作用[16]。DNMT3B作用于活性基因的主要酶甲基化内区，其招募受染色质修饰、转录水平、非编码RNA和存在的DNA结合因子机制调节。而DNMT3B表达的改变与肿瘤的发生有关[17]。此结果提示，IFNG-AS1可通过FSIP2、PYGM、TTLL1和LIMD2的表达增加，ATP2A1、ESCO2和DNMT3B表达降低，从而促进细胞增长、DNA重组和染色体修饰。本研究验证的7个DEPs与TMT标记定量结果高度一致，证实了蛋白质组学结果的可靠性。

综上，本实验通过定量蛋白质组学分析，在jurkat细胞中鉴定LncRNA IFNG-AS1的下游效应因子。结果表明LncRNA IFNG-AS1上调FSIP2、PYGM、TTLL1、LIMD2，下调ATP2A1、ESCO2、DNMT3B在促进ALL进展中发挥了关键作用，并提示了LncRNA IFNG-AS1上调反应的复杂性。本实验蛋白质组学结果为ALL的诊断和治疗提出了新的可能策略。