海藻酸钠固定烟曲霉菌强化玉米秸秆的预处理

宋志伟， 温雪晨， 孙彩玉， 盛 涛

(1.黑龙江科技大学 教务处， 哈尔滨 150022； 2.黑龙江科技大学 环境与化工学院， 哈尔滨 150022)

0 引 言

纤维素类生物质是地球上最丰富的可再生资源之一，我国是农业大国，纤维素类资源十分丰富，但其日常焚烧及丢弃对环境造成很多恶劣影响[1]。纤维素类生物质的资源化有4个步骤：预处理、糖化、发酵及产物的提取，其中预处理是限制纤维素类生物质资源化的瓶颈之一。这是因为木质纤维素利用的主要障碍在于覆盖在纤维素和半纤维素表面致密的木质素结构，使得酶水解的表面积非常小[2]，因此，提高纤维素和半纤维素的糖化率，从木质纤维素生物质中去除或有效分解木质素至关重要。常见的预处理方式有物理化学法、物理法、化学法和生物法。物化预处理法效率高[3]，但存在着容易造成二次环境污染、成本高、副产物抑制等问题[4]。与物化预处理技术相比，生物预处理是一种环境友好的预处理方法，可以在温和的条件下破坏秸秆结构，同时能耗更低，流程和设备更简单，且不会对环境产生危害[5]。然而，在以往的生物预处理过程中，存在木质纤维素降解菌大多对于生长环境有着严格的要求，在强酸、强碱、高盐、重金属、高温、强辐射、紫外、干旱、高渗等情况下，这些微生物会失去活性，丧失功能等问题，使得降解菌在预处理过程中不能发挥最大的降解能力。因此，强化预处理过程中微生物的抗逆性，增加降解效果变得尤为重要。

笔者将海藻酸钠作为包埋载体固定化烟曲霉菌CLL，考察固定化细胞对玉米秸秆预处理效果的影响，并通过响应面模型优化固定化条件，为秸秆类纤维素类生物质的资源化应用提供新型高效的生物预处理技术。

1 实 验

1.1 材 料

1.1.1 底物和接种物

底物玉米秸秆采自哈尔滨市黑龙江大学农场，65 ℃ 下烘干至恒重，粉碎过60筛并贮藏备用。烟曲霉菌CLL(A.fumigatusCLL)来自黑龙江科技大学微生物实验室，30 ℃ 条件下，在马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 平板固态培养成熟后，取3块带有真菌菌丝体的PDA培养基(直径约 0.9 cm)在液态马丁培养基中培养3 d后，取菌悬液备用。

1.1.2 纤维素酶

里氏木霉纤维素酶：里氏木霉(DSM768)在黑龙江科技大学微生物实验室获得，并采用液态发酵的方式生产和分离了里氏木霉纤维素酶。简单地说，在温度29 ℃，转速120 r/min的条件下，利用纤维素产酶培养基(1.4 g/L的(NH4)2SO4；0.3 g/L的尿素；2.0 g/L的磷酸氢二钾；0.3 g/L的MgSO4·7H2O；0.3 g/L的氯化钙；20 g/L的麦麸；5 g/L的豆饼粉；8 g/L的微晶纤维素)培养里氏木霉4 d后，以8 000 r/min、4 ℃ 离心10 min，收集上清液作为里氏木霉纤维素酶。商用纤维素酶购自Novozymes(1 000 U/g)，由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-D葡萄糖苷酶组成。

1.1.3 固定化烟曲霉菌CLL小球的制备

将海藻酸钠(Sodium alginate，以下简称SA)加热溶于水，冷却后与烟曲霉菌CLL菌悬液(菌悬液质量浓度为40 g/L)混合均匀，使SA最终质量浓度为20～40 g/L，将SA与菌体混合液用针形管滴入50～100 g/L的CaCl2溶液中，固定化7～8 h后滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。

1.2 方 法

制备条件的优化

通过3因素3水平实验分析，对载体质量浓度(20、30、40 g/L)、交联剂质量浓度(50、75、100 g/L)和交联时间(7、8、9 h)进行优化，在30 ℃的条件下培养10 d，2 d取样一次，以木质素降解率为响应值。

1.2.2 玉米秸秆的预处理

采用优化后的固定化烟曲霉菌CLL(A.fumigatusCLL)小球在液态条件下(以玉米秸秆底物，底物质量浓度为100 g/L)预处理玉米秸秆24 d，每2 d取样一次，测定玉米秸秆中的木质素、纤维素、半纤维素的降解率。

1.2.3 分析方法

木质纤维素原料的组成采用ANKOM 自动纤维分析仪测定。 JSM6480型扫描电子显微镜测定玉米秸秆的结构。利用双面胶带将待表征玉米秸秆样品固定在铜片上,使用Hummer I真空镀膜机在氩气存在的条件下用Au-Pd为样品镀金后，使用SEM(JEOL-JSM 6480 LVSEM at 20 kV)观察玉米秸秆的表面结构。玉米秸秆官能团变化采用 Perkin Elmer Spectrum 100 FT-IR 光谱仪测定。所有实验均重复3 次，均值用标准差表示。使用配备有 Bio-Rad Aminex HPX-87H 色谱柱和折射率检测器(RID) 的高效液相色谱 (HPLC) (1260 Infinity, Agilent Technologies, USA) 分析水解产物的成分。柱箱和检测器的工作温度分别为 70 ℃和 55 ℃。使用 H2SO4(2 mmol/L) 作为流动相，以0.6 mL/min的流速进行洗脱。

2 结果与讨论

2.1 固定化条件对玉米秸秆预处理效果的影响

2.1.1 响应面法优化固定化条件

固定化小球对玉米秸秆预处理的效果通常受到温度、pH值、交联剂的质量浓度、载体质量浓度、交联时间等条件的影响[7]，文中通过响应面优化法对固定化小球的制备条件(载体质量浓度、交联剂质量浓度、交联时间)等进行3因素3水平的优化实验，其中载体质量浓度ρ1分别设置为20、30、40 g/L；交联剂质量浓度ρ2分别设置为50、75、100 g/L；交联时间t分别设置为7、8、9 h，响应面的响应值为木质素降解率η1。由表1可知，在ρ1为30 g/L、ρ2为75 g/L、t为8 h的条件下，制成的以SA为载体的烟曲霉菌CLL固定化小球对玉米秸秆的预处理效果最佳，预处理10 d后，对玉米秸秆中木质素降解率为37.79%。

表1 实验因素水平及编码值Table 1 Test factor levels and coded values

2.1.2 二次回归模型的建立与显著性分析

根据表2中的3×17CCD分析结果，同时利用Design Expert 进行回归分析，建立了木质素降解率回归方程为

表2 木质素降解率的回归模型方差分析及系数显著性检验Table 2 Regression model analysis of variance and coefficient significance test for lignin degradation ratio

η1=-415.425 62+5.594 16ρ1+0.070 693 0ρ2+

84.799 3+0.004 264ρ1ρ2-0.023 725ρ1t+

5.375 37t2。

该模型F值为685.04，P<0.001，表明模型拟合较好。模型的调整确定系数R2为 0.992 8，说明这个模型能解释99.28%响应值的变化。结果表明该方程可以从统计学角度预测各影响因素对木质素降解率的影响。

2.1.3 降解效果的响应面分析与优化

每个响应面分别代表一个变量保持恒定条件下剩余两个变量之间的交互作用。从图1可以看出，每个响应面都出现了一个明显的峰值，说明最佳的固定化条件在选取实验设计范围内。随着载体质量浓度、交联剂质量浓度以及交联时间分别由20 g/L、50 g/L、7 d增加到30 g/L、75 g/L、8 d，玉米秸秆中木质素的降解不断增加，但当载体质量浓度、交联剂质量浓度和交联时间继续增加至40 g/L、100 g/L、9 d时，玉米秸秆各组分降解率不再增加甚至显著减少。这是由于海藻酸钠浓度越高，固定化细胞的强度越大，但是，当浓度过高，高于30 g/L时，固定化细胞无法生长；当浓度过低时，固定化球会破裂。当交联剂浓度(CaCl2)较低，低于75g/L时，固定化球较软，易破碎。随着交联剂浓度的增加，由于盐的高渗透压，微生物细胞活性降低[8]。一般来说，海藻酸盐凝胶需要足够的时间来完成Ca2+与糖链骨架中活性位点之间的协调[9]，Moreno-Garrido研究发现，交联时间越长，凝胶的机械强度越强，生物质固定化效率越高，然而，交联时间过长可能会使凝胶的结构变紧，当交联时间超过8 h时，便不再利于基质的传递和生物活性的发挥[10]。

图1 不同参数对玉米秸秆中木质素降解率的影响响应面立体分析Fig. 1 Response surface three-dimensional analysis of effect of different parameters on degradation ratio of lignin in corn stalks

2.2 玉米秸秆的预处理效果

通过响应面优化固定化条件最终确定，在载体质量浓度30 g/L、交联剂质量浓度75 g/L、交联时间8 h的条件下制作的固定化烟曲霉菌CLL小球对玉米秸秆的预处理效果最好，使用最佳固定化条件下制作的固定化小球在30 ℃条件下，在液态条件下(底物质量浓度10 g/L)发酵玉米秸秆24 d，每2 d取样一次。如图2所示，在预处理第4 d时，玉米秸秆中木质素的降解率明显增加至25.6%，说明在预处理第4 d时，玉米秸秆开始被降解，此时纤维素和半纤维素初步暴露出来，因此降解率没有显著增加。随着预处理时间的不断增加，木质素结构逐渐被破坏，随即纤维素和半纤维素大面积暴露，在预处理中期时(6～16 d)，玉米秸秆中各组分的降解率不断提高，在预处理第16 d时，木质素、纤维素和半纤维素的降解率分别达到52.4%、29.23%和27.69%。在预处理第18～24 d时，玉米秸秆中各组分的降解率基本稳定，最终在预处理24 d时，玉米秸秆中木质素、纤维素、半纤维素的降解率分别可达到55.9%、32.72%、31.76%。

图2 固定化烟曲霉菌 CLL对玉米秸秆的降解效果Fig. 2 Effect of immobilized Aspergillus fumigatus CLL on degradation of corn stalks

2.3 玉米秸秆的结构特征

图3 玉米秸秆的 SEM图片Fig. 3 SEM images of corn stalks

图4 玉米秸秆的FTIRFig. 4 FTIR of corn stalks

2.4 预处理后玉米秸秆的糖化率

玉米秸秆资源利用的最终手段是糖化玉米秸秆中的纤维素类物质，预处理过程可以破坏包裹在纤维素类物质表面的一层致密木质素结构，从而释放纤维素和半纤维，强化纤维素、半纤维素糖化效果。在糖化过程中，起到关键作用的是纤维素酶。纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物以及微生物都有合成或分泌纤维素酶的能力，其中微生物主要包括真菌、细菌、放线菌等，针对真菌的研究比较多，其中，真菌降解纤维素最好的代表是里氏木霉，里氏木霉是丝状好氧真菌，具有高效的降解潜力，工业上已形成完整的以里氏木霉生产纤维素酶的工业链[14]。

文中分别使用商品纤维素酶和里氏木霉纤维素酶对经固定化烟曲霉菌CLL预处理后的玉米秸秆进行糖化，结果见图5。

图5 纤维素酶对玉米秸秆糖化效果的影响Fig. 5 Effect of cellulase on saccharification effect of corn stalks

在预处理第4 d时，糖化率达到峰值，其中，里氏木霉纤维素酶对玉米秸秆的糖化率可达69.8%，商品纤维素酶的糖化率可达68.6%，这是由于在预处理4 d时，木质素初步被降解，纤维素和半纤维素暴露出来且未被降解损耗。随着预处理时间的增加，纤维素和半纤维素逐渐被降解，导致糖化率不断下降；在预处理16d时，里氏木霉纤维素酶和商品纤维素酶对玉米秸秆的糖化率已经低至25.4%和24.1%，且在糖化过程中，里氏木霉纤维素酶对玉米秸秆的糖化效果略优于商品纤维素酶的糖化效果。由于商品纤维素酶价格昂贵，因此这也为纤维素类生物质资源化节约了一定成本。

3 结 论

(1)在海藻酸钠质量浓度为30 g/L、交联剂质量浓度为75 g/L、交联时间为8 h的条件下，制作的固定化烟曲霉菌CLL小球对玉米秸秆的预处理效果最佳。

(2)在预处理24 d时，玉米秸秆中木质素、纤维素、半纤维素的降解率分别为55.9%、32.72%、31.76%。使用里氏木霉纤维素酶糖化玉米秸秆，在预处理第4 d时，可得到69.8%的最大糖化率，此时玉米秸秆的的资源化利用效率最高。