天鹅维氏气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌与大肠埃希氏菌混合感染的诊断

白新栋，王 斌，王晨骁，王小园，王 娟，刘海金，杨增岐，党如意

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)属于弧菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性短杆菌，广泛存在于水体及土壤中，绝大多数菌株是动物肠道内正常菌群，而一些致病性菌株，是水生生物尤其是鱼类的重要致病菌[1-2]，亦可引起其他多种动物和人的感染，导致胃肠炎甚至败血症等[3-4]。近年来，关于维氏气单胞菌的病例报道逐年增多，其流行呈明显上升趋势且危害越来越严重[5-6]。

弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii) 属于肠杆菌科枸橼酸杆菌属，革兰氏染色阴性，是人和动物肠道内的正常菌群，并且也普遍存在于自然界中，是一种典型的人-兽-水生生物共患病条件性致病菌[7-8]。近年来有关弗氏柠檬酸杆菌感染多种水生生物、哺乳动物和人的病例报道越来越多，表明该菌对动物和人类的危害有加重的趋势[9]。

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)属于肠杆菌科埃希氏菌属，为革兰氏阴性直杆菌，广泛分布于自然界中，绝大多数于正常条件下是人和动物肠道内共栖菌，一定条件下可致病，少数具有致病性，通常将此类大肠埃希氏菌称为致病性大肠埃希氏菌，可引起许多动物和人的多种病型的大肠杆菌病[10]。

2021年5月，购自陕西蓝田县某养殖基地的4只观赏用天鹅，于某人工湖饲养2周内先后发病，且其中1只死亡。根据临床症状、病理变化、细菌学检测结果及小鼠致病性试验结果确诊该病死天鹅为维氏气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌混合感染，并对分离菌株进行了药敏试验，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 营养琼脂、MH琼脂，青岛海博生物技术有限公司产品；绵羊血，采自西北农林科技大学实验动物中心健康绵羊；革兰氏染液，北京索莱宝科技有限公司产品；细菌微量生化反应管，杭州滨和微生物试剂有限公司产品；药敏纸片由本实验室参考欧盟药敏试验标准(EUCAST 2017)自行制备并低温保存；DNA标准DL 2 000、2×TaqPCR Mix，Gen Star公司产品；引物合成和产物测序由西安擎科生物公司完成；

1.1.2 主要仪器 细菌浊度仪，杭州齐威仪器有限公司产品；XP基因扩增仪，杭州博日科技有限公司产品；金属浴恒温器，杭州瑞诚仪器有限公司产品。

1.1.3 病料及实验动物 无菌采集该病死天鹅病变较为严重的组织器官，包括肺脏、肝脏和十二指肠；昆明系SPF级小鼠，购自成都达硕实验动物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 临床检查与病理剖检 对天鹅发病情况及临床症状进行问诊和视珍，并对死亡天鹅进行剖检，观察病理变化。

1.2.2 细菌学检测

1.2.2.1 细菌分离培养与染色镜检 无菌采集该病死天鹅的肺脏、肝脏和十二指肠，分别接种于血平板培养基，37 ℃培养24 h，择取优势菌再进行纯化培养，观察菌落特征，并挑取单菌落进行革兰氏染色、镜检，观察染色特性及菌体形态。

1.2.2.2 生化鉴定 挑取分离菌株纯培养物分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、枸橼酸盐、硫化氢、尿素、蛋白胨水(加靛基质1滴～2滴)、磷酸盐葡萄糖胨水(加MR试剂1滴)等细菌微量生化反应管中，于37 ℃ 培养18 h ～ 24 h，观察反应并记录，结果参考《伯杰细菌鉴定手册》第8版进行判断。

1.2.2.3 分子生物学鉴定 通过煮沸裂解法制备分离菌株DNA，用16S rRNA基因通用引物对1号和2号分离菌株DNA进行16S rRNA基因PCR扩增，将PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳并核验目的条带后，送由西安擎科生物公司测序，然后将所得序列提交NCBI官网进行Blast序列比对，并选取数据库中同源性较高的部分菌株序列，利用MEGA7.0软件构建系统进化树。用大肠埃希氏菌种特异性鉴定引物对3号分离菌株进行PCR鉴定。引物信息见表1。

表1 引物信息

1.2.3 小鼠致病性试验 分别挑取各分离菌株的纯培养物于无菌生理盐水中制备细菌悬液，然后利用细菌浊度仪将各菌液含菌量调至约1.5×108CFU/mL。将12只小鼠随机分为4组(n=3)，对照组小鼠每只腹腔注射0.2 mL无菌生理盐水，试验组分别为维氏气单胞菌感染组、弗氏柠檬酸杆菌感染组和大肠埃希氏菌感染组，每组小鼠分别腹腔注射0.2 mL对应菌液，然后于相同条件下饲养，观察小鼠状态及死亡情况，如有死亡立即对其进行病理解剖并采取脏器进行细菌分离培养，同时对照组小鼠予以相同处理。

1.2.4 药敏试验 采用纸片扩散法对3株分离菌株进行17种抗菌药物的敏感性检测，操作步骤严格按照欧盟药敏试验标准委员会(EUCAST)制定的标准试验方法进行。药物敏感程度判断参考EUCAST公布的兽用抗菌药物的耐药判定标准。

2 结果

2.1 临床症状与病理变化

从陕西蓝田某地共购进4只天鹅，饲养2周内先后均发病，其中1只死亡，发病天鹅表现精神沉郁，食欲减退，腹泻症状明显，肛门处羽毛被粪便污染。对死亡天鹅进行病理剖检发现十二指肠起始端有暗红色出血灶，黏膜表面散在出血和充血；肝脏右叶被膜有多量纤维素附着，与腹气囊粘连；脾脏被膜面可见两个黄白色坏死灶；肺脏右侧被膜面有多量纤维素覆盖；心包膜有多量纤维素渗出，与右侧胸内膜粘连，心包腔积液，且混有黄色团块样物质；右侧腹气囊纤维素渗出。根据流行病学、临床症状及病理变化，初步怀疑为大肠杆菌病和(或)其他细菌性疾病。

2.2 细菌学检测结果

2.2.1 菌落特征与细菌形态 从该天鹅肺脏、肝脏和十二指肠共分离到3种细菌，分别命名为1号分离菌株、2号分离菌株和3号分离菌株。1号分离菌株在血琼脂培养基上生成灰白色、边缘整齐、表面光滑的菌落，能形成β溶血环(图1-1a)；革兰氏染色阴性，菌体呈短粗杆状，两短钝圆(图1-1b)。2号分离菌株在血琼脂培养基上生成灰白色、中央稍隆起、表面光滑、黏稠的菌落(图1-2a)；革兰氏染色阴性，菌体呈直杆状，两短钝圆(图1-2b)。3号分离菌株的菌落形态与1号分离菌株相似，但无溶血现象(图1-3a)；革兰氏染色阴性，菌体呈长杆状，两短钝圆(图1-3b)。

1a、1b.1号分离菌株；2a、2b.2号分离菌株；3a、3b.3号分离菌株

2.2.2 生化鉴定结果 生化试验结果显示(表2)，1号分离菌株生化结果符合维氏气单胞菌生化特性，初步表明其为维氏气单胞菌。2号分离菌株生化结果符合弗氏柠檬酸杆菌特性，初步表明其为弗氏柠檬酸杆菌。3号分离菌株生化结果符合大肠埃希氏菌特性，初步表明其为大肠埃希氏菌。

表2 分离菌株生化鉴定结果

2.2.3 分子生物学鉴定结果 1号分离菌株和2号分离菌株的16S rRNA基因PCR扩增结果显示，约在1 300 bp处出现特异性条带，与目的条带大小一致(图2)。16S rRNA基因测序结果表明1号分离菌株的16S rRNA基因序列与GenBank中已登录的多个维氏气单胞菌的相似度均在99.0%以上，2号分离菌株的16S rRNA基因序列与GenBank中已登录的多个弗氏柠檬酸杆菌的相似度均在97.98%以上，分别各选取3株同源性较高的菌株序列，以沙门氏菌作为外群，构建系统进化树(图3)，1号分离菌株与维氏气单胞菌聚为一支，表明1号分离菌株为维氏气单胞菌。2号分离菌株与弗氏柠檬酸杆菌聚为一支，表明2号分离菌株为弗氏柠檬酸杆菌。3号分离菌株的大肠埃希氏菌PCR鉴定结果为阳性(图4)，表明3号分离菌株为大肠埃希氏菌。

M.DNA 标准DL 2 000;+.阳性对照；1.1号分离菌株；2.2号分离菌株；-.阴性对照

图3 分离菌株16S rRNA 基因遗传进化树

M.DNA 标准DL 2 000;+.阳性对照；3.3号分离菌株；-.阴性对照

2.3 小鼠致病性试验结果

注射菌液12 h后，维氏气单胞菌感染组、弗氏柠檬酸杆菌感染组、大肠埃希氏菌感染组小鼠均出现精神沉郁、行动迟缓、扎堆、腹泻等症状，对照组小鼠无明显症状。18 h ～ 36 h，维氏气单胞菌感染组小鼠死亡2只，弗氏柠檬酸杆菌感染组和大肠埃希氏菌感染组小鼠各死亡1只，其余小鼠2周内正常存活。对死亡小鼠及对照组小鼠剖检，3个组试验组小鼠的病理变化主要表现在小肠、肝脏、肺脏和脾脏(图5)。3个组试验组小鼠的小肠(以十二指肠为例)，均表现严重水肿，并伴有不同程度出血(图5 A1 B1 C1 D1)，其中以弗氏柠檬酸杆菌感染组最为严重(图5 C1)。弗氏柠檬酸杆菌感染组小鼠的肝脏以充血、潮红为主要特点(图5 C2)，而维氏气单胞菌感染组(图5 B2)与大肠埃希氏菌感染组(图5 D2)小鼠的肝脏以淤血、暗红为主要特点。3个组试验组小鼠的肺脏均表现不同程度出血(图5 A3 B3 C3 D3)，脾脏均表现不同程度淤血肿大(图5 A4 B4 C4 D4)。将3个组试验组小鼠的上述病变组织进行细菌分离培养后，可分别再次获得各组对应感染菌。总之，该结果表明3株分离菌株对小鼠均有一定致病性。

A1、A2、A3、A4.对照组小鼠十二指肠、肝脏、肺脏、脾脏；B1、B2、B3、B4.维氏气单胞菌感染组小鼠十二指肠、肝脏、肺脏、脾脏；C1、C2、C3、C4.弗氏柠檬酸杆菌感染组小鼠十二指肠、肝脏、肺脏、脾脏；D1、D2、D3、D4.大肠埃希氏菌感染组小鼠十二指肠、肝脏、肺脏、脾脏

2.4 药敏试验结果

3株分离菌株的药物敏感性试验结果见表3。该维氏气单胞菌分离株对头孢噻呋钠、链霉素、庆大霉素、替米考星、恩诺沙星敏感，对阿莫西林、复方阿莫西林、氨苄西林等12种药物耐药。该弗氏柠檬酸杆菌分离株对链霉素、庆大霉素、氟苯尼考、多西环素、金霉素敏感，对替米考星中介，对阿莫西林、复方阿莫西林、氨苄西林等10种药物耐药。该大肠埃希氏菌分离株对链霉素、庆大霉素敏感，对恩诺沙星中介，对阿莫西林、复方阿莫西林、氨苄西林等14种药物耐药。该结果表明3株分离菌株均已产生严重的多重耐药性，建议使用链霉素或庆大霉素等敏感药物对发病天鹅进行治疗。

表3 分离菌株药敏试验结果

3 讨论

在临床检查和病理剖检的基础上，本试验对该病死天鹅进行细菌学检测，通过细菌分离培养、革兰氏染色、镜检、生化鉴定、16S rRNA基因扩增及测序和PCR检测，结果从天鹅脏器中分离到3种细菌，分别为维氏气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌，小鼠致病性试验表明3株分离菌株均有致病性，且都能造成小鼠肠道严重损伤，进而导致腹泻，该结果与天鹅疾病特征有共同之处，因此最终确诊该病死天鹅为维氏气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌的混合感染。药敏试验结果显示，3株分离菌株均已产生严重的多重耐药性，针对其治疗可选择的敏感药物种类较少，给临床防控带来较大困难。

在水体环境中，维氏气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌广泛存在，且在夏秋两季繁殖最快，在水体恶化或动物机体免疫力降低时，动物感染风险增大且死亡率增高[2,11]。天鹅为大型水禽，喜欢群栖在湖泊和沼泽地带，主要以水生植物为食。天鹅的生活特性决定其不可避免会受到维氏气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌的健康威胁。本病例中的天鹅饲养于西北农林科技大学南校区人工湖，该湖为死水湖，春夏之际水温不断升高导致各种细菌大量繁殖，且伴随多次降雨后地面维氏气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌大量滋生并随水流入湖，水质持续恶化。饮用污染水源，对天鹅健康构成严重威胁，且在新的环境应激下机体抵抗力有所下降时，相关病原菌便会“乘虚而入”引起天鹅发病，所以应避免天鹅群饮用污染水源，并做好饲养管理，提高机体抵抗力。同时，本病例提示在对天鹅等珍禽引进前要对水体质量进行监测并最好进行阶段性药物预防。

维氏气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌都是淡水鱼类细菌性疾病的常见病原菌，给水产养殖业造成巨大经济损失，同时也都是重要的人、兽及水生生物共患病原菌，威胁着人类健康。近年来越来越多的病例报道表明其两者的流行呈上升趋势，且危害不断加重，耐药性也不断增强，可能是尚未被人们充分认识的病原菌，应当提高对其重视程度[5,9,12]。