云南省江城县山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测及序列分析

张娜西，孟锦昕，李钊，何于雯，王德琼，李楠，孙建美，白方，王静林

（1.江城县动物疫病预防控制中心，云南江城 665900；2.云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒重点实验室，云南昆明 650224；3.江城县农业农村和科学技术局，云南江城 665900）

山羊地方性鼻内肿瘤（enzootic nasal tumor，ENT）是由山羊地方性鼻内肿瘤病毒（enzootic nasal tumor virus，ENTV）感染引起山羊鼻内黏膜上皮细胞异常增生的一种慢性、进行性、传染性肿瘤疾病[1]，临床主要表现为食欲减退、日益消瘦、运动减少、呼吸困难，最终因呼吸衰竭而死亡，病死率最高可达100%，对山羊健康养殖危害较大[2-4]。该病在世界范围内广泛分布，除大洋洲外，其他大洲均有分布，不同地区的发病率为0.1%～15.0%[5-11]。1975 年内蒙古赤峰市首次报道了ENT 流行[12]，随后湖南、四川、陕西、福建、贵州、安徽、重庆、广西和广东等地区相继报道了该病的流行，发病率为0.5～40.0%[4，13-21]。近年来，该病在我国山羊中的流行呈明显上升趋势。目前，在云南省尚未有发现ENT 病例的报道。本研究对2017年在云南省南部边境地区江城县采集的羊全血样本进行了随机PCR（random PCR）扩增以及ENTV检测，并对测序获得的基因序列进行了分析，明确云南省江城县存在ENTV 流行，这为云南省进一步开展ENT 调查以及山羊呼吸道疾病的诊断和预防提供了依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集和保存

2017 年8 月在江城县宝藏乡一农户养殖的山羊群中，采用真空采血管，从山羊颈静脉采集血液，每只山羊采集肝素抗凝血5 mL，颠倒混匀后，4 ℃保存带回实验室，3 000 r/min 离心5 min，取出上清（血浆）分装成每管500 μL，-85 ℃冰箱保存。

1.2 随机PCR 扩增

从冰箱中取出山羊血浆样本，每份取出200.0 μL 加到同一离心管中，混匀，经0.22 μm滤膜（Millipore 公司）过滤，38 000g超离2 h，用200.0 μL 灭菌PBS 重悬，用QIAamp Viral RNA Mini Kit（美国QIAGEN 公司），按说明书提取病毒RNA。参照文献[22]进行随机PCR 扩增：以20 μmol/L K2Sr（5′-GACCATCTAGCGACCTCCACNNNNNN-3′）为引物，采用PrimeScript ™RT reagent Kit 试剂盒（TakaRa 公司，大连）合成cDNA 第一链；94 ℃ 2 min 预变性第一链cDNA，加入0.5 μL Klenow 酶（5 U/μL，TakaRa 公司，大连）合成cDNA 第二链。以3.0 μL 合成的cDNA为模板，K2S（5′-GACCATCTAGCGACCTCCAC-3′）为特异性引物，作随机PCR 扩增。在反应体系中依次加入焦碳酸二乙酯处理水（DEPC）38.5 μL、10×Ex-Taq缓冲液5.0 μL、K2S（20 μmol/ L）1.5 μL、dNTP（10 mmol/L）1.5 μL、Ex-Taq酶（5 U/μL）0.5 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min、65 ℃ 3 min，反应40 个循环；最后68 ℃延伸5 min。将随机PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收＞500 bp 的片段；采用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（TakaRa 公司，大连）进行胶回收纯化，纯化产物与载体pMD19-T（TakaRa 公司，大连）连接，转化DH5α 感受态细胞；取2.0 μL 菌液作模板，用KS 引物进行PCR 扩增（58 ℃退火，共25 个循环），1%琼脂糖凝胶电泳检测载体中有无插入片段；将有插入片段的克隆，送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司进行测序；将获得的序列在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）资料库中进行BLAST 在线比对，确定插入序列来源。

1.3 ENTV RT-PCR 检测

1.3.1 引物设计 参照ENTV-2 CHN1（KU258870）全基因序列，采用Primer Premier 5.0 软件设计3条引物（ENTV5375F：5′-TCCCGGAGAGGCTGGTACGC-3′；ENTV6036R：5′-GGTGCCCAATCCCATAAAAGG-3′；ENTV6020R：5′-AAAGGGTGGCATCGGCGTTG-3′），用于半巢式RT-PCR 扩增病毒env基因。第一轮扩增目的基因片段大小为662 bp，第二轮为646 bp，引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 病毒RNA 提取、反转录合成cDNA 第一链和RT-PCR 从-85 ℃冰箱中取出山羊血浆样品，用QIAamp Viral RNA Mini Kit（美国QIAGEN 公司）试剂盒提取每份血浆样品的病毒RNA，制备cDNA。每份样品取2.00 μL cDNA 作为反应模板，首先采用ENTV 5375F 和6036R 引物进行第一轮扩增，依次加入10×Buffer 5.00 μL，dNTP（2.5 mmol/L）5.00 μL，上下游引物各1.25 μL，Ex-Taq酶0.75 μL，去离子水31.75 μL，充分混匀。94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30s，72 ℃ 60 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min。然后取2.00 μL 第一轮扩增产物作模板，采用ENTV 5375F 和6020R 引物，按照第一轮扩增的体系和条件进行第二轮扩增；对第二轮扩增产物用1%琼脂糖电泳检查扩增，扩增阳性产物送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司测序。

1.4 序列分析

使用MEGA X 软件中的AlING 进行病毒基因核苷酸序列比对，DNAstar 软件中的MegAlign 进行核苷酸同源性分析；使用MEGA X 软件完成基于最大似然法（ML）方法的系统进化树绘制，筛选最佳模型，bootstrap 值为1 000。

2 结果与分析

2.1 血浆样品随机PCR 扩增

采用随机PCR 对20 份羊血浆样品进行扩增、克隆测序，获得序列经Blastn（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对，发现有两个克隆分别获得452 个核苷酸（nt）和305 个nt 的序列，与Betaretrovirus属ENTV 2型（ENTV-2）中国福建流行株ENTV/CH/GT/2015（MK210250）和四川流行株ENTV-2CHN1（KU258870）同源性最高，为98.0%～99.0%，提示该批羊群中存在ENTV-2 感染。

2.2 血浆样品巢式PCR 扩增及氨基酸差异位点分析

对20 份山羊血浆样品采用巢式PCR 进行扩增，结果4 份样品（编号JC47、JC48、JC50 和JC57）扩增为阳性（4/20）。对阳性产物测序共获得4 条570 个nt 的序列，编码190 个氨基酸。氨基酸位点分析发现，4 份样品的ENTV env 蛋白186 位和204 均发生“G →E”氨基酸突变，而这2 个氨基酸位点在我国其他地方流行的ENTV、绵羊肺腺瘤病病毒（jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）上均保守；此外，JC57 样品序列上的env蛋白178 位还发生了“T →P”的氨基酸突变（图1）。

2.3 ENTV env 基因系统进化分析

将测序获得的4 条ENTVenv基因序列与18条GenBank中下载的ENTV-2、ENTV-1 和JSRV相应序列一起进行系统进化分析。进化分析结果（图2）显示，获得的4 条序列形成一个较小的进化簇。它们之间的核苷酸同源性为98.6%～99.8%，氨基酸同源性为99.5%～100%（表1）；这4 条序列与我国四川、福建等地流行的ENTV-2 形成一个较大的进化簇，核苷酸同源性为96.3%～99.5%，氨基酸同源性为95.3%～99.0%，而与ENTV-1 和JSRV 形成不同的进化分支，核苷酸同源性低于93.7%，氨基酸同源性低于95.8%。

表1 ENTV 部分env 基因核苷酸及其编码氨基酸同源性分析结果 %

3 讨论

近年来ENT 在全球范围的流行呈上升趋势。该病的发病率不高（0.1%～15.0%），但病死率非常高，几乎为100%[5-6，21]，对山羊健康危害非常严重。特别是近年来随着我国经济的发展和人民生活水平的提高，羊肉需求及养殖数量不断增加，ENT流行范围不断扩大，流行频率不断增强[21]。在云南省周边的四川、重庆、贵州和广西等地区的羊群中均有ENT 流行的报道[15-16，18，20-21]。本研究首次在云南省江城县山羊群中检测到了ENTV-2，发现其遗传进化关系与四川、福建等地流行的病毒亲缘关系密切，同源性较高，提示云南省江城县羊群中流行的ENV-2 可能与四川、福建省的流行毒株相关。随着我国交通运输系统的完善，跨省调运动物便利性提高，导致存在一定的ENT 流行风险，因此云南省需要加强ENT 监测，了解其在云南省山羊群中的流行情况及其病原遗传变化特征。

ENTV-2env基因编码的蛋白具有重要的生理功能，其与山羊的鼻道筛骨上皮细胞癌变密切相关，可能是一种致瘤基因[23]。本研究对江城县山羊中检测到的ENTV-2 env 蛋白190 个氨基酸位点进行分析发现，保守位点186 位和204 均发生“G →E”的氨基酸突变，由中性氨基酸突变为酸性氨基酸，这可能会导致蛋白表面电荷发生改变，至于是否会影响病毒的一些生物学功能，还有待进一步研究。这2 个保守位点的氨基酸突变，可能是江城县ENTV-2 毒株特有的分子特征，这为进一步对该地区ENTV-2 流行毒株进行研究奠定了基础。