荔仁总皂苷抗鸭乙型肝炎病毒感染的实验性研究*

苏惠萍，韦朋海，覃 彬，黄斯梅，蒙明虑，熊国林，谢志春

（广西医科大学公共卫生学院流行病学教研室，南宁 530021）

荔枝盛产于我国广东、福建和广西南部，是我国南方地区的主要水果之一，其果肉、叶、核、皮均具有一定的药用价值[1]。荔仁（Litchi Semen）为无患子科植物荔枝Litchi chinensisSonn.的干燥成熟种子，表皮为紫棕色或棕红色，呈圆形或长圆形，形似卵，表面光滑略有凹陷或细波纹，味微甘、苦、涩，性温，归肝肾经，是我国药典收载的中药。据文献报道，荔仁在抗肿瘤、降血糖、抗氧化以及改善学习记忆等方面均有一定的效果[2-3]。刘莹等[4]发现荔仁活性成分对肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌等多种肿瘤具有广泛的抑制作用。Zhao等[5]用荔仁含药血清作用于肝癌HepG2细胞，发现其能显著抑制肝癌HepG2细胞的生长，进而抑制肝癌血管的生成。此外，蒋蔚峰等[6]用荔仁总皂苷进行了抗HBV的体外实验研究，结果发现荔仁总皂苷的抗乙肝病毒作用与拉米夫定相近，不仅能够抑制HepG2.2.15细胞HBsAg及HBeAg 的表达，还能控制HBV-DNA 的复制。本研究拟通过感染乙肝病毒的麻鸭作为动物模型，对荔仁总皂苷抗乙肝病毒作用作进一步验证，为开发治疗病毒性乙型肝炎新药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

1 日龄广西麻鸭，体重40～50 g，雌雄均可，购于广西南宁市饲料兽药禽苗公司，饲养于通风良好的环境，定时给食，自由饮水，室温（25±5）℃，相对湿度40%～70%，12 h 光照昼夜循环。本研究经广西医科大学动物伦理委员会批准。

1.2 病毒血清

收集本地成年广西麻鸭的血液，将分离得到血清经普通聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）和琼脂糖凝胶实验证实为阳性病毒血清，存于-80 ℃冰箱中备用。

1.3 实验用药

实验所用荔仁购于南宁市景昌中药饮片有限公司，产地为广西。将晒干后的荔仁粉碎，取荔仁碎颗粒3 kg，加入浓度为50%乙醇回流浓缩，再用石油醚对浓缩后的滤液萃取2 次、水饱和正丁醇溶液纯化5次，得到荔仁总皂苷粉末193.42 g（即1 g荔仁总皂苷相当于15.51 g生药）。经香草醛－冰醋酸－高氯酸比色法测定其皂苷纯度约为49.06%。阿昔洛韦（aciclovir，ACV），购自湖南迪诺制药有限公司，规格：0.1 g/片，批号：140230。

1.4 主要试剂及仪器

HBsAg 和HBeAg 检测试剂盒（酶联免疫法）购自上海荣盛生物药业有限公司；天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒和丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒均购自上海执诚生物科技股份有限公司。MyCycler 型梯度PCR 仪，美国Bio-Rad 公司；GelDoc XR+型凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；7100型日立全自动生化分析仪，日本日立公司；CFX96™Real-Time PCR Detection System，美国Bio-Rad 公司；Multiskan GO 型全波长酶标读数仪，美国Thermo Scientific公司。

1.5 造模、分组及给药

将1 日龄麻鸭适应性饲养12 h，观察麻鸭饮食和精神状态无异常后，向每只鸭子腹腔注射含阳性鸭乙肝病毒血清0.2 mL，观察1 周后经右侧颈静脉采血0.5 mL并分离血清，用普通PCR法筛选出呈阳性感染的麻鸭60 只，常规饲养至13 日龄作为实验动物模型。将60 只鸭乙型肝炎病毒DNA（duck hepatitis B virus DNA，DHBV-DNA）呈阳性的麻鸭按随机数字表法分为5 组，每组12 只：荔仁总皂苷高、中、低剂量组（分别为640 mg/kg、320 mg/kg、160 mg/kg）、ACV 阳性对照组（ACV 组）（200 mg/kg）和模型对照组。每天定时经灌胃给药1次，连续给药14 d。模型对照组每天给予每只鸭子2 mL 蒸馏水，ACV 组每天给予每只鸭子200 mg/kg 的ACV溶液。

1.6 采血和取肝组织标本

在给药前（T0）、给药后7 d（T7）、14 d（T14）和停药后5 d（P5）从鸭右颈静脉取血1.5 mL，室温静置1 h，分离得到血清样本，存于-80 ℃冰箱中待检。停药5 d后将鸭子处死，剖腹摘取肝脏，取肝右叶中部1 cm×1 cm×1 cm肝组织，用10%福尔马林溶液固定，经苏木精－伊红（HE）染色后光镜下观察病理组织学形态。

1.7 乙肝病毒学及肝脏转氨酶检测

1.7.1 DHBV-DNA 检测 在1.5 mL 离心管中加入量为1:5 的裂解液和麻鸭血清，水浴锅煮沸10 min后取出降至室温，再经10 000 r/min 离心15 min 后分层，吸其上清液即为DNA 提取液。将DNA 提取液采用实时荧光定量聚合酶连式反应（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）的方法检测鸭乙肝病毒载量。

1.7.2 鸭乙肝表面抗原（DHBsAg）和鸭乙肝病毒e抗原（DHBeAg）检测 使用酶联免疫吸附法（ELISA），按试剂盒说明书的方法检测血清样本中DHBsAg和DHBeAg OD值。

1.7.3 ALT和AST检测 按试剂盒说明书操作，用7100 型日立全自动生化分析仪检测麻鸭血清样本中ALT和AST活性。

1.8 肝组织病理切片观察

将所有鸭肝组织切片置于光学显微镜下观察，统计肝脏炎性病变的不同类型以及病变所占范围。参考我国《病毒性肝炎防治方案》及国际常用的METAVIR、Ishak和Scheuer计分系统[7]，对麻鸭肝脏组织标本病变范围的估计主要分为4个级别：（1）无病变；（2）轻度病变（即病变占整个视野的范围≤1/3）；（3）中度病变（1/3＜病变占整个视野的范围≤2/3）；（4）重度病变（即病变占整个视野的范围＞2/3）。统计各组麻鸭肝脏组织病变程度的分布情况，并将整理后的数据进行统计学分析。

1.9 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计软件、R 4.0.2 软件进行统计分析，GraphPad Prism 9.3.0 软件进行绘图，计量资料以均数±标准差（）表示。满足球形检验要求的多次测量资料，可用重复测量资料的方差分析，不满足要求则用多元方差分析。计量资料同一组内均值的两两比较采用独立样本t检验，等级资料采用秩和检验及扩展t检验进行两两比较分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 给药前、后各组DHBV-DNA载量变化情况

与同组T0相比，荔仁总皂苷3个剂量组在T7、T14及P5均呈现抑制病毒活性的效果并存在良好的量效关系（P＜0.01），其中高剂量组的效果最佳。P5时各组DHBV-DNA 均有回升现象，但ACV 组的DHBV-DNA 回升现象比荔仁总皂苷高剂量组明显，说明高剂量荔仁总皂苷能更稳定地抑制病毒反弹。见表1。

表1 各组给药前、后不同时间点DHBV-DNA载量的变化情况拷贝数的对数值，n=12，

表1 各组给药前、后不同时间点DHBV-DNA载量的变化情况拷贝数的对数值，n=12，

与同组T0比较，a)P＜0.01，b)P＜0.05。

2.2 给药前、后各组DHBsAg 和DHBeAg OD 值的变化情况

不同组中不同时间点的DHBsAg 和DHBeAg OD 值均未有明显变化，同一组中DHBsAg 和DHBeAg OD 值在给药前、后相比，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见图1。

图1 各组给药前、后不同时间点DHBsAg和DHBeAg OD值变化

2.3 给药前、后各组ALT和AST活性变化情况

与同组T0相比，在T14时荔仁总皂苷高剂量组对ALT活性表现出抑制效果（P＜0.05）。ACV 组和荔仁总皂苷高剂量组在T7、T14及P5均有降低AST活性的作用（P＜0.05）。见图2。

图2 各组给药前、后不同时间点ALT和AST活性变化

2.4 肝组织病理学检查结果

感染DHBV后，麻鸭肝组织病变类型最主要的病变类型为胞浆疏松化、肝汇管区炎症和肝细胞气球样变，依次占比为80%（48/60）、72%（43/60）和42%（25/60）；其余为嗜酸性变和点灶状坏死，见图3和表2。Kruskal-Wallis 秩和检验结果显示，不同治疗组的鸭乙型肝炎疗效比较，差异均具有统计学意义（χ2=21.038，P＜0.01）。扩展t检验进行两两比较结果显示，ACV组、荔仁总皂苷高、中剂量组与模型对照组比较，差异有统计学意义（t=3.624、3.210、3.171，均P＜0.01），前3 组以轻度病变为主，重度病变数量少甚至无，而模型对照组重度病变数量较多。另外，荔仁总皂苷低剂量组的病变程度与模型对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

图3 麻鸭肝脏组织的不同病变类型分布（HE染色）

表2 各组麻鸭肝脏病理改变类型及数量n=12

表3 各组麻鸭肝脏病变程度数量统计n=12

3 讨论

鸭乙型肝炎动物模型是抗乙肝病毒中药筛选中最为经济、方便及高效的模型[8-9]，本实验利用该模型进一步评价荔仁总皂苷抗鸭乙肝病毒的作用，发现其具有较好的抗病毒效果和护肝作用。在实验中，模型对照组麻鸭血清中的DHBV-DNA 水平无大幅度波动，阳性对照药物ACV可显著抑制血清DHBV-DNA，表明模型的建立和使用比较理想[10-11]。给药治疗后，荔仁总皂苷能显著抑制HBV的复制并且不会出现停药后显著病毒反跳，体现了其在抗HBV治疗方面的优势，作用机制可能与抑制体内共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）的复制有关。

然而荔仁总皂苷3个剂量组均未表现出有明显的抑制DHBV 分泌DHBsAg 和DHBeAg 的作用。分析其原因可能有：（1）给药剂量太低未达到有效血药浓度，荔仁总皂苷在前期细胞实验中已表现出对DHBsAg 和DHBeAg 表达的抑制作用，且抑制作用随时间的延长、剂量的增加随之增强[6]；（2）给药时间可能太短，因不同药物的作用机制不同，药物起效所需时间也存在不同；（3）荔仁总皂苷在体内实验中没有抑制DHBsAg和DHBeAg表达的效果。

国内有学者报道，荔仁能明显降低小鼠急性酒精肝损伤模型[12]、四氯化碳肝损伤模型和硫代乙酰胺肝损伤模型[13]血清中AST 及ALT 含量。本研究中荔仁总皂苷高剂量组在给药后及停药后5 d均能够降低AST活性，在给药后14 d后才出现降低ALT活性的作用，可能与AST、ALT 出现的顺序有关。肝脏病理检查显示大部分麻鸭肝脏主要存在胞浆疏松化和肝脏汇管区炎细胞浸润这两种病变类型，未观察到大片肝细胞坏死病灶，区别于人类乙型肝炎中常见的汇管区炎症和点灶状坏死病变，提示鸭HBV 与人类HBV 在某些方面可能存在不同之处[14-15]。用药治疗后，与模型对照组相比较，ACV组与荔仁总皂苷高、中剂量组均能有效减少由DHBV引起的重度肝脏炎性病变。

综上所述，荔仁总皂苷在体内实验中具有较好的抗乙肝病毒以及改善肝脏病理学的作用，抑制病毒反弹效果优于阳性对照药物ACV，且能降低AST活性。但其抑制DHBsAg 和DHBeAg 分泌作用不明显。此外，荔仁总皂苷在抗病毒机制、护肝降酶作用机制以及抗纤维化等方面还有待进一步研究，以此为开发应用荔仁总皂苷提供更多的理论依据。