基于UPLC-Q-TOF-MS技术的益智种子和果皮成分分析

王茂媛　王祝年　王清隆　羊青　张旻　晏小霞

摘  要：基于UPLC-Q-TOF-MS技術对益智种子和果皮乙醇提取物的非挥发性成分进行分析。采用回流提取法制备供试样品，采用超高效液相色谱仪分离益智种子和果皮乙醇提取物化学成分，以Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm× 2.1 mm，1.8 μm）色谱柱为分析柱，0.1%甲酸水溶液–0.01%甲酸乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱，流速0.3 mL/min，质谱采用电喷雾离子源（ESI），四极杆-飞行时间质谱采集其一级和二级高分辨质谱数据，并用Masslynx软件对原始质谱数据进行分子特征提取，结合文献报道信息，综合分子相应结构特征、精确相对分子质量和质谱裂解规律，对化合物结构进行识别鉴定。从益智种子和果皮乙醇提取物中分别鉴定32个和50个非挥发性成分，包括黄酮类、酚酸类、糖类、脂肪酸类和萜类化合物等5类成分，其中有58个化合物为首次从益智中分离得到;益智种子的主要成分为酚酸类（11个）化合物，也是益智种子的代表性成分，占总鉴定结构化合物总数的三分之一，而益智果皮中的酚酸类成分较少，仅鉴定得到6个酚酸类化合物;益智果皮主要成分为黄酮类（19个）化合物，占总鉴定结构的化合物总数近三分之一，且种类丰富，而种子中仅鉴定得到1个黄酮类化合物;二者中共有成分仅4个，分别是单糖类化合物D-gluconic acid、D-glucopyranuronic acid，二糖类化合物sucrose和黄酮类化合物chysin。结果表明，益智种子非挥发性化学物质较少，而益智果皮中含有的化学物质种类较多;益智种子和果皮的化学成分差异较大：益智种子主要成分为酚酸类活性物质，益智果皮则以黄酮和萜类成分为主，在综合利用和质量控制上应区别对待使用。

关键词：UPLC-Q-TOF-MS;益智种子和果皮;成分分析中图分类号：S567.239      文献标识码：A

 The purpose of this paper was to analyze and identify the nonvolatile components of the ethanol extract in the seeds and peels of . The extracts were prepared by the refluxing methods， high-resolution mass spectrometric data of the extract were collected by the ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight-tandem mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS）. The main components in the extracts were separated by the gradient elution method with waters ACQUITY UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm， 1.8 μm）， the mobile phase consisted of 0.1% formic acid and 0.01% formic acid acetonitrile， with the flow rate of 0.3 mL/min. Mass spectrometry was applied for the qualitative analysis with ESI ion source. Through molecular feature extraction （MFE）， Masslynx software was then used to process the original MS data. Furthermore， the structures of the compounds were speculated according to the MS fragmentation patterns and confirmed by comparison with reference standards. Thirty-two and fifty compounds were identified from the seeds and peels respectively， including flavonoids， phenolic acids， saccharides， fatty acids and terpenes. 58 compounds were isolated from the plant for the first time. The main constituents of the seeds were phenolic acids （11 compounds）， which were representative constituents of the seeds， accounting for one third of the total identified structural compounds of the seedsOn the contrary， there were few phenolic acids in the peels. The main constituents of the peels were flavonoids （19 compounds） of various kinds， accounting for one third of the total identified structural compounds of the peelsOn the contrary， there was only one flavonoid identified in the seeds. A total of 4 components were found both in the nonvolatile component of the ethanol extract in the seeds and peels， including monosaccharides of D-gluconic acid and D-glucopyranuronic acid，  disaccharide of sucrose， flavonoid of chysin. The results showed that the nonvolatile components of the seeds were lesser than that of the peels. The chemical constituents of the seeds and peels were found to be quite different. The main constituents of the seeds were phenolic acids， and the main constituents of the fruit were flavonoids and terpenoids. It should be treated differently in comprehensive utilization and quality control of the seeds and peels of .

UPLC-Q-TOF-MS; seeds and peels of  ; chemical constituents

： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.021

益智（Miq.）为姜科山姜属植物，是我国著名的四大南药之一，也是海南省道地药材，在广西、广东、福建、云南等省（区）也有分布。益智以干燥成熟果实入药，商品名为益智仁、益智子，为我国历版药典收载，具有暖肾固精缩尿，温脾止泻摄唾等功效，用于肾虚遗尿，小便频数，遗精白浊，脾寒泄泻，腹中冷痛，口多唾涎等症。益智是民间常用药材，也是卫计委公布的药食同源原料，被广泛应用在我国许多著名方剂、中成药或保健品中，如缩泉丸、遗溺汤、补原丸、益智酒、益智调味酱、益智茶等。已有研究表明益智含有挥发油类、二苯庚烷类、黄酮类、萜类、甾醇及其苷类等化学成分，具有保护神经、抗氧化应激、抗糖尿病肾病、改善肠胃功能、镇静催眠、抗肿瘤、抗菌等功效。益智在现代临床上有去壳（果皮）和带壳两种使用方法，然而历版中国药典记载益智（果实）作为饮片炮制时，需除去外壳（果皮），以捣碎的种子或种子团残瓣入药或进一步炮制使用，约占干燥果实29%～31%的果皮作为废弃物被丢弃，存在益智药材资源浪费的问题。近年来，关于益智种子和果皮化学成分的比较研究多集中在挥发油、总黄酮、总多糖和低聚糖等主要成分的含量对比分析，而采用HPLC技术对益智种子和果皮化学成分的对比分析较少，尚未弄清二者的化学物质组成和区别，尤其是非挥发性成分组成及对比更鲜见报道。因此，为科学发掘益智资源的利用价值，有必要明晰益智种子和果皮的非挥发性化学物质组成和区别。基于此，在前期研究基础上，笔者首次采用UPLC-Q-TOF-MS技术建立与现有中药质量控制发展水平相符合的检测方法，完成对益智种子和果皮乙醇提取物非挥发性化学成分的定性分析，通过对比分析传统药用部位益智种子和废弃物益智果皮非挥发性化学成分类别和组成，以阐明益智资源的内涵，为明确其非传统药用部位的开发利用价值提供科学依据，同时也为益智炮制和临床使用及其相关产品的开发，完善质量标准提供参考。

 材料与方法

 材料

1.1.1  植物材料  益智果实于2018年5月采摘于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业农村部热带药用植物种质圃，经王祝年研究员鉴定为姜科山姜属植物益智（  Miq.）的干燥成熟果实。人工剥离，分别获得益智种子和益智果皮。

1.1.2  仪器与试剂  Xevo G2-XS QTof液质联用仪，美国Waters公司;Secura513-1CN精密天平，德国Sartorius公司;KQ3200DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;5810R高速冷冻离心机，德国Eppendorf Centrifuge公司;索氏提取器，四川蜀玻玻璃仪器有限公司;Masslynx V4.1工作站，美国Waters公司;Waters UNIFI科学信息系统，美国Waters公司。

乙腈（质谱纯），美国Fisher公司;甲酸（质谱纯），德国Merck Millipore公司;蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司;KG2211W离心管（1.5 mL），美国KiRGEN公司;一次性无菌注射器，丰临医疗器械有限公司;Pall GHPAcrodisc Syringe滤膜（0.2 μm、13 mm），美国Pall公司;Labmed移液枪头，美国Labmed Biotech公司;2 mL样品瓶，美国Waters公司;Oasis HLB 3cc （60 mg） Extraction Cartridges，美国Waters公司。

方法

1.2.1  供试品溶液制备  益智种子和益智果皮经粉碎后，分别精密称取粉末1 g，加石油醚200 mL，于60℃水浴锅提取3次，每次30 min。提取残渣用冰水冷却、抽滤、除去石油醚。再将残渣分别用70%乙醇50 mL于80℃回流提取3次，每次30 min，合并3次的提取液。分别取益智种子和益智果皮70%乙醇提取液1 mL，冷冻离心（12 000 r/min，10 min，4℃），静置1～2 min，取上清500 μL過HLB固相萃取柱，先用1 mL 5% MeOH洗脱，再用1 mL95% MeOH洗脱，收集95% MeOH洗脱液，过0.2 μm微孔滤膜，转至2 mL透明样品瓶，标记为益智种子（Z）和益智果皮（K），4℃冰箱保存备用。

1.2.2  UPLC-Q-TOF-MS分析  取1.3.1制备的益智样品进行分析。

UPLC色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流动相：0.1%甲酸水溶液（A）–0.01%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱（0～1 min，1%～25% B;1～7 min，25%～55% B;7～15 min，55%～99% B;15～17 min，99%～99% B;17～20 min，99%～1% B;）;流量：0.3 mL/min;柱温40℃;进样量1 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），离子源温度100℃;正、负离子模式的毛细管电压3.0、2.0 kV;锥孔电压40 V;低能量碰撞电压（CE）6 V，高能量碰撞电压20～60 V;去溶剂化温度450℃;去溶剂化气体流量600 L/h;锥孔气体流量50 L/h;扫描范围 50～1200，扫描时间0.2 s，检测时间20 min。

1.2.3  定性分析  应用LC-MS液质联用仪采集数据，进行益智种子和益智果皮化学成分的定性分析。利用UNIFI科学信息系统，提取化学成分的一级质谱及二级碎片数据。基于强大精确质谱分析平台和ChemSpider在线检索数据库，结合文献报道信息，综合化合物相应结构特征、精确相对分子质量和质谱裂解规律，对化学组分进行识别鉴定，降低假阳性。

 结果与分析

 益智种子、果皮提取物的化学成分鉴定

基于UPLC-Q-TOF-MS技术分别在正、负离子模式下，对益智种子和益智果皮的化学成分进行定性分析。通过Masslynx软件进行初步分析及图谱信息对比，其中负离子（–）ESI-MS出峰响应较高，分离效果较好。因此，以益智种子和益智果皮的（–）ESI-MS数据导入UNIFI进行详细的化学成分鉴定，根据鉴定结果（表1、表2），标记化合物的出峰位置，如图1所示。

根据检测到的化合物精确相对分子质量（保留4位小数）、特征碎片、保留时间和峰型参考，综合文献报道信息及在线数据库检索结果，分析得到益智种子中32个化合物，益智果皮中50个化合物。

  化合物分析

2.2.1  单糖和二糖类化合物  糖类是植物光合作用形成的初级产物，也是绝大多数天然产物生物合成的初始原料。从益智的果皮和种子中共鉴定得到7个单糖和二糖类化合物，结果见图2。其中单糖D-gluconic acid（K2，Z1）和D-glucop yranuronic acid（K3，Z2），二糖sucrose（K4，Z3）是益智果皮和种子所共有成分，单糖D-galactitol（K1）和二糖4-O-[（5xi）-4-deoxy-β- L-threo-hexopyranuronosyl]-α-D-galactopyranuronic acid（K5）仅在益智果皮中鉴定得到。从益智种子中鉴定得到2个二糖类化合物α-cellobiose（Z4）和4-O-hexopyranosylhex-2-ulofuranose（Z5）。其中K1和K2/Z1是单糖的糖醇结构，是天然界分布很广的一类成分，具有甜味。K2、Z1为直链D-葡萄糖酸，K3、Z2为D-葡萄糖酸的六元环结构，K4和Z3是二糖蔗糖。

2.2.2  脂肪类化合物  脂肪类化合物又称開链化合物，是有机分子中的碳原子连接成链状，如长链烯烃、酮类、脂肪醇类和脂肪酸类等。脂肪类

化合物广泛存在于植物体内，是合成复杂有机分子的前体成分。从图2可知，益智果皮中鉴定得到4个脂肪类化合物包括1，10-decanediyl bisac rylate（K37）、leukotriene B5（K44）、tetradecylα-D-galactopyranosyl-（1-4）-α-D-galactop yranosyl-（1-4）-α-D-galactopyranoside（K46）、linolic acid（K49）。其中K37、K44和K49是脂肪烯酸结构，K46是脂肪酸的糖苷结构。从益智种子中鉴定得到5个脂肪酸类化合物，其中化合物pentadecanedioic acid（Z11）和9，10- dihydroxystearic acid（Z25）是长链脂肪酸，化合物（7E，9E，11E）-7，9，11-tridecatrienoic acid（Z12）、13-hydroxyoctadecadienoic acid（Z27）和oleic acid（Z32）是多烯脂肪酸结构。

2.2.3  酚酸类化合物  酚酸类成分在植物中广泛分布，其基本结构是酚羟基取代的芳香羧酸。从益智果皮中仅鉴定得到6个酚酸类化合物（图3），化合物1-（3，4-dimethoxyphenyl）-1-methoxy-3-（2，4， 6-trimethoxyphenyl）-2-propanol（K18）、2，5-dime thoxybenzyl 3-（3，4，5-trimethoxyphenyl） propanoate（K20）、1，1'-[oxybis（2，1-ethanediyloxy-2，1-ethane diyloxy）] bis（2-methoxybenzene）（K22）和3-（hexanoyloxy）-2-butanyl 3，4，5-trimethoxybenzoate（K35）均为多羟基取代苯酚的甲氧基衍生物，另外鉴定得到益智的特征性化合物，二苯基庚烷类成分hexahydrocurcumin（K25）和tetrah ydrocurcumin（K28）。酚酸类化合物是益智种子的代表性成分，共鉴定得到11个化合物，其中化合物3，4，5-trihydroxy-1-cyclohexenecarboxylic acid（Z6）、salicylic acid（Z7）、4'-hydroxy-3'-pre nylacetophenone（Z16）、（+）-varitriol（Z19）、1-（3，4-dimethoxyphenyl）-1-hexanone（Z20）、

2-[2-（2-hydroxymethyl-3-methoxy-phenyl）-vinyl]-5-methyl-tetrahydro-furan-3，4-diol（Z21）和octylphenol（Z24）是苯酚类化合物的甲氧基衍生物。化合物trans-caffeic acid（Z10）、homovanillic acid（Z13）和（2E）-5-hydroxyferulic acid（Z14）是多羟基取代苯丙酸类成分。

2.2.4  萜类化合物  萜类化合物是一类以五个碳为基本单元，组成的骨架庞杂，种类繁多的化合物。根据碳原子数的多少分为单萜（10个碳）、倍半萜（15个碳）、二萜（20个碳）和三萜（30个碳）。从益智果皮和种子中共鉴定得到12个萜类化合物（图4），其中从益智果皮中鉴定的萜类化合物包括7个二萜类化合物：cytosporin E（K33）、carnosic acid（K39）、（-）-andrographolide（K41）、florlide A（K42）、（3R，3aS，4S，8aS）-3-hyd roxy-3-isopropyl-6，8a-dimethyl-8-oxo-1，2，3，3a，4，5，8，8a-octahydro-4-azulenyl （2E）-2-methyl-2-butenoate（K45）和rabdoternin A（K47）均为复杂环状二萜类成分，并且鉴定得到1个三萜类化合物ginsenoside F1（K50），是达玛烷型三萜的葡萄糖苷。益智种子中的萜类成分包括单萜：（1R，5S，6R）-2，7，7-trimethylbicyclo[3.1.1]hept-2-en-6-yl L-galactopyranoside（Z8）、二萜：（2Z，4E）-3-methyl-5-[（1S，2R，4S）-1，2，4-trihydroxy-2-（hydroxymethyl）-6，6-dimethylcyclohexyl]-2，4-pentadienoic acid（Z15）、2-（8-hydroxy-4a，8-dime thyldecahydro-2-naphthalenyl）acrylic acid（Z22）和kandenol A（Z23），其中化合物Z22和Z23是双环倍半萜。从益智种子中仅鉴定得到一个半日花烷型二萜的葡萄糖苷（2R，4aR，5S，6R）- 6-hydroxy-5-[（3E）-5-hydroxy-3-methyl-3-penten-1-yl]-1，1，4a，6-tetramethyldecahydro-2-naphthalenyl β-D-allopyranoside（Z30）。

2.2.5  黄酮类化合物  黄酮类化合物是自然界最为重要的一类天然有机化合物，其结构以C-C₃-C为基本骨架。从益智的果皮和种子中共鉴定得到20个黄酮类化合物，结果见图5。从益智的果皮中分离鉴定得到19个黄酮类化合物：其中quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl（1-2）-β-D- glucopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside（K7）、quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl（1-6）-β-D-glucopyranoside（K9）、quercetin-5-O-α-L-rhamno pyranosyl（1-6）-α-D-glucopyranoside（K10），miq uelianin（K12）、quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside（K13）和quercetin（K23）均为槲皮素的葡萄糖、鼠李糖和葡萄糖酸的糖苷衍生物及苷元;luteolin-7-O-β-D-glucuronopyranosyl-（1-6）-β-D-gl ucopyranoside（K8）、luteolin-7-O-glucoside（K17）和luteolin（K26）是木犀草素的葡萄糖、葡萄糖

酸的糖苷和苷元;apigenin-7-O-β-D-glucopy ranoside（K11）、malonylapiin（K15）和apigenin（K24）是芹菜素的糖苷衍生物和苷元;kaempferol-3-O-rutinoside（K14）和kaempferol-3- glucuronide（K16）是山奈酚的糖苷類化合物;liquiritigenin（K36）为二氢黄酮;procyanidin B1（K6）为花青素;另有3，5，7-trihydroxy-flavone- 3-O-β-D-glucoside（K19）、7，4'-dihydroxy-flavone- 7-O-β-D-glucoside（K21）和chysin（K27）。从益智种子中鉴定得到2个黄酮类化合物：chysin（Z17，K27）和isalpinin（Z18），其中chysin（Z17，K27）是种子和果皮的共有成分。

2.2.6  其他类化合物  如图6所示，从益智果皮中鉴定得到其他成分有蒽酮类6-decylubiquinone（K40）和5-O-methyl embelin（K43），以及脂

肪链与环氧环酮以及苯环结合形成的化合物（5E）-7-{4-hydroxy-2-[（1E）-3-hydroxy-1-octen-1-yl]-6-oxotetrahydro-2H-pyran-3-yl}-5-heptenoic acid（K30）、（-）-prostaglandin E2（K32）、3，4-Bis[（6- hydroxyhexyl）oxy]benzoic acid（K34）、（5E）-7-{3- [（1E）-3-hydroxy-1-octen-1-yl]-2，6-dioxabicyclo[3.1.1]hept-4-yl}-5-heptenoic acid（K38）、3α-hydroxy- 3，5-dihydromonacolin L acid （K29）、stigmatellin Y（K48）和penisporolide A（K31）。如图6所示，从益智种子中鉴定得到的其他类成分为：联苯类化合物4-decylbiphenyl（Z31），大环醚类化合物tetracosahydrodibenzo[b，n][1，4，7，10，13，16，19，22]oc taoxacyclotetracosine（Z29），以及环状脂肪烯的糖苷衍生物3-（β-D-Galactopyranosyloxy）-2-hydro xypropyl 8-{（1S，5S）-4-oxo-5-[（2Z）-2-penten-1-yl]- 2-cyclopenten-1-yl}octanoate（Z26）、（2E，6E）-3，7， 11-trimethyl-2，6，10-dodecatrien-1-yl （5xi）-6-O-[（4xi）- 6-deoxy-L-lyxo-hexopyranosyl]-β-D-ribo-hexopyranoside（Z28）。

  讨论

通过文献分析发现，大多研究以益智挥发油为主要活性物质和研究对象，其含量较高的成分有圆柚酮、p-聚伞花烃、香橙烯、姜酮等。随着柱层析等分离手段的多样化，益智中的多种成分如倍半萜类、二苯庚烷类、黄酮类、挥发油类、甾体及其苷类等化学成分也被分离鉴定出来，但未见关于益智种子和果皮非挥发性物质全面系统分析的报道，本研究基于UPLC-Q-TOF-MS技术对益智种子和果皮乙醇提取物非挥发性成分进行了分析和鉴定，从益智种子和果皮中分别鉴定了32个和50个化合物，其中有58个化合物为首次从益智中鉴定得出。

通过对比益智种子和果皮乙醇提取物非挥发性成分发现，二者的组成成分类型基本相似，都含有黄酮类、酚酸类、糖类、脂肪酸类和萜类化合物等5类成分，但主要成分差异较大：其中益智种子的主要成分为酚酸类（11个）化合物，也是益智种子的代表性成分，占总鉴定结构化合物总数的三分之一，而益智果皮中的酚酸类成分较少，仅鉴定得到6个酚酸类化合物;益智果皮主要成分为黄酮类（19个）化合物，占总鉴定结构的化合物总数近三分之一，且种类丰富，而种子中仅鉴定得到1个黄酮类化合物，吴德玲等也曾报道益智果皮总黄酮和总多糖的含量明显高于益智种子;在益智果皮中发现了益智特征性化合物二苯基庚烷类（2个）成分，分别是hexahydrocurcumin（K25）和tetrahydrocurcumin（K28），其中K28首次从益智中分离到，而在种子中并未发现，推测有可能二苯基庚烷类化合物更多的富集在果皮中，梁木恒等曾报道益智果皮中的二苯基庚烷类化合物相较于益智种子更为丰富;在果皮中还首次发现了1个三萜化合物Ginsenoside F1（K50），为达玛烷型的葡萄糖苷，从种子中也首次鉴定得到一个半日花烷型二萜的葡萄糖苷（Z30）。此外，虽然种子和果皮的组成成分类型相似，但二者具体类型的化合物组成存在较大的差异：二者样品中仅有4个共有成分，分别是2个单糖类化合物D-gluconic acid、D-glucopyranuronic acid，1个二糖类化合物sucrose和1个黄酮类化合物chysin。本研究结果与此前的研究有较大差异，这可能跟提取方法和检测方法有关。

研究发现益智种子非挥发性化学物质较少，而益智果皮中含有的化学物质种类较多，尤以黄酮类成分为主，在后期对益智资源综合开发利用时，应特别予以关注。研究益智总黄酮的提取工艺和方法，探究其开发利用的可行性;此外，益智不同部位均有一定的利用价值，在充分利用益智仁的同时，深入挖掘益智非传统药用部位潜在开发利用价值，如可以考虑从果皮中提取糖类成分，形成果胶产品等，深入研究其他可利用部位的价值，变废为宝，以实现对其可利用部位的综合利用。

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