贵州越夏期与越冬期中华蜜蜂病毒病发生的调查

张 铭，罗丽林，张丽娜，刘 曼*，侯春生*

(1. 中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100193；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081；3. 贵州省生物研究所，贵阳 550009)

蜜蜂作为重要的传粉昆虫，主要是通过授粉来提高和维持农业生产力与生物多样性(Forgáchetal., 2008; Abrol, 2012; Houetal., 2020)。由于其在不同生长阶段受到不同程度的环境压力如水污染、大气污染，农药如新烟碱、吡虫啉等危害，导致近年来蜜蜂数量大幅下降(Ivanaetal., 2014; Shietal., 2018)，同时面临多种如胡蜂、大蜡螟Galleriamellonella、蚂蚁等虫害的威胁，但病原如真菌、细菌与病毒是最主要原因(Yadavetal., 2017)。其中蜜蜂病毒病是造成蜜蜂数量减少的最重要原因之一(Wuetal., 2014)。大部分蜜蜂病毒属于小核糖核酸病毒家族的一类小RNA病毒(Yuanetal., 2017)，目前发现的蜜蜂病毒约有30种(Gisder and Genersch, 2015)。然而，并非所有病毒感染后都会出现明显感染症状，只有少数病毒如蜜蜂残翅病毒和囊状幼虫病毒感染后会出现典型的发病症状，大多数蜜蜂感染病毒后除了行动迟缓无明显症状出现(Vesnaetal., 2018)。

贵州省处于中国西南内陆地区腹地，属于亚热带湿润季风气候，具有充足的蜜粉源，尤其适合我国特有蜂种-中华蜜蜂Apisceranacerana的养殖。近十年由于各种蜜蜂病毒病的感染及与其它病原的混合感染，导致出现爬蜂和蜂群下降或死亡现象，使蜜蜂群势大幅下降。在蜂群四季管理中，越夏期和越冬期对蜜蜂的生存与发展具有重要意义，尤其是越夏期除了高温，还是蜜蜂天敌、巢虫以及各种病毒流行与传播的高发季节，同时还存在着蜂王产卵减少的现象(Liang, 2014)。而越冬期，由于温度较低花粉储存不充足，如有病毒病的存在将使蜜蜂难以越冬或越冬后蜂群数量不足(Qiu, 2019)。因此，为了更好的了解贵州省越夏期和越冬期的蜜蜂病毒病发生情况，本研究调查了2019年6月至8月、2019年11月至2020年1月为期6个月的蜜蜂病毒病的感染情况，以期为蜜蜂病毒病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1中华蜜蜂样本采集

实验所用蜜蜂采集自2019年6月至8月、2019年11月至2020年1月，采样地点位于贵州省兴义市、息烽县、台江县、龙里县。每个采样点采集20～30头蜜蜂置于密封袋内带回，液氮速冻后置于-80℃冰箱长期保存直至用于检测。

1.1.2试剂与仪器

Trizol购自Invitrogen公司，反转录试剂盒Goscript reverse transcription system购自普洛麦格(Promega, Madison, WI, USA)公司，聚合酶2×Es Taq MasterMix购自康为世纪生物科技(CW Biotech)公司，其它化学试剂均为国产分析纯级试剂，引物合成在博迈德(Biomed)进行，离心机Centrifμge 5417R购自Eppendorf，电热恒温水浴锅DK-2000-ⅢLA购自天津市泰新特仪器有限公司，电泳仪JY300HE购自君意电泳有限公司，凝胶成像系统FR200A购自复日科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1DNA提取

取2～3头蜜蜂，于研钵中加液氮研磨成粉末后取约0.05 g加入含1 mL细胞裂解液和10 μL蛋白酶K的1.5 mL离心管中，65℃水浴加热 30 min，不断摇匀，12 000 rpm离心5 min，取上清液，然后加入等体积酚、氯仿、异戊醇混合物(25 ∶ 24 ∶ 1)混匀，12 000 rpm离心5 min，取上清液，加入等体积氯仿混匀，12 000 rpm离心5 min，取上清液，加入2倍体积乙醇或1倍体积异丙醇，于室温下放置2 min，12 000 rpm离心10 min，弃掉上清液，加入1 mL 75%乙醇洗涤1次，12 000 rpm离心5 min，弃掉上清液，蒸发酒精，而后加入30～50 μL ddH2O溶解，55℃水浴10 min，得到总DNA，测定浓度后用于后续试验。

1.2.2RNA提取

取2～3头蜜蜂，于研钵中加液氮研磨成粉末后取约0.05 g加入含1 mL Trizol溶液的1.5 mL离心管中，静置5 min，在4℃条件下12 000 rpm离心10 min，取上清液，加入200 μL氯仿，混匀，于室温下静置2～3 min，12 000 rpm离心15 min，取上清液，加入500 μL异丙醇，混匀，于室温下静置10 min，在4℃条件下12 000 rpm离心10 min，弃掉上清液，加入1 mL 75%乙醇，振荡，在4℃条件下7 500 rpm离心5 min，弃掉上清液，干燥5～10 min，加入20～50 μL ddH2O溶解，得到总RNA。

1.2.3RT-PCR扩增

将所得DNA进行扩增，反应体系如下：模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL(表1)，2×Es Taq MasterMix 10 μL，无菌水7 μL。反应条件为94℃ 2 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30～33个循环，72℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 mg/mL溴化乙锭)检测鉴定。

将所得总RNA测定浓度后取4 μg用Goscript reverse transcription system反转录试剂盒合成第一链cDNA，所有实验步骤均按说明书要求进行操作。cDNA扩增反应体系与DNA扩增反应体系和反应条件相同，所需引物如表2所示，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 mg/mL溴化乙锭)检测鉴定。

1.3 数据分析

使用Simca 14.1软件(Pomerantsevetal., 2014)绘制Principal Component Analysis (PCA)主成分分析图对实验结果进行分析。

表1 本实验检测蜜蜂丝状病毒所用引物序列

表2 本实验检测RNA病毒所用引物序列

2 结果与分析

2.1 越夏期蜜蜂病毒感染情况

为确定该月份主要流行的病原，通过Simca 14.1进行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)。不同月份相对接近的位置显示不同病毒，相对位置越近代表相关性越强，则该病毒在该月份的传播性越广(图1)。对贵州省越夏期6月、7月、8月的检测发现，6月份和7月份以SINV病毒流行最广，8月份则以AmFV病毒进行小范围流行。其中6月份感染病毒种类最多为7种，而7月份和8月份只感染两种病毒。因此，贵州省越夏期以SINV为主要流行病毒且以6月份为病毒的高发季。

图1 越夏期蜜蜂病毒感染情况Fig.1 Occurrence of bee viruses during over-summering注：横纵坐标分别代表第一、第二主成分，其中第一、二主成分为7月和8月。Note: X and Y axis represented the first and second principal component respectively, and the first and second principal component were July and August.

2.2 越冬期蜜蜂病毒感染情况

对贵州省越冬期11月、12月及次年1月病毒检测发现，这3个月份皆以BQCV和SBV为主要流行病毒(图2)。不同于越夏期，越冬期每个月蜜蜂感染病毒种类均在5～8种。因此，越冬期不仅以SBV和BQCV为大范围主要流行病毒，而且其它病毒也可能在蜂群中进行小范围传播。

图2 越冬期蜜蜂病毒感染情况Fig.2 Occurrence of bee viruses during the over-wintering注：横纵坐标分别代表第一、第二主成分，其中第一、二主成分为11月和12月。Note: X and Y axis represented the first and second principal component respectively, and the first and second principal component were November and December.

2.3 混合感染情况

相较于其他多重感染，不管是越夏期还是越冬期，二重感染的频率都是最高的(图3)。虽然越夏期出现二重和三重感染的频率明显低于越冬期，但是越夏期出现三重、四重甚至五重感染的频率较平均，而越冬期的混合感染频率随着感染重数的增加而下降。值得关注的是，在越夏期6月份经常出现的LSV和VDV，二者常与其它病毒混合感染，它们单独出现在混合感染中的频率分别为50%和42.9%，二者结合出现在混合感染中的频率为35.7%。

图3 越夏期和越冬期混合感染率Fig.3 Mixed infection during the over-summer and over-wintering注：横轴表示混合感染的重数，纵轴表示混合感染率。Note: X axis represented the multiplicity of mixed infections, and Y axis represented the rate of mixed infections.

3 结论与讨论

贵州省气候适宜，地形多样，具有充足的蜜粉源植物，为贵州养蜂业提供了巨大的发展空间，而其养蜂业的发展最早可追溯至1 000多年前，自唐代一直至清代，贵州蜡染一直是历代的主要贡品。然而这样一个具有悠久养蜂历史的大省近年来也被各种蜜蜂病原所困扰，尤其是蜜蜂病毒的高发。根据对贵州省息烽县、台江县、龙里县、兴义市的检测结果显示，越夏期以SINV为主要流行病毒，尤以6月份为病毒主要传播月份；越冬期以SBV和BQCV为主要传播病毒，且各类病毒似乎将越冬期作为它们的潜伏期。同时，越夏期和越冬期蜂群都存在着不同程度的混合感染，虽然越夏期出现了二重、三重、四重甚至五重混合感染，但是混合感染的频率在总体上要低于越冬期。

值得注意的是，越夏期流行病毒SINV、ALPV在越冬期并未被检测出，而最普遍感染且需被重点关注的曾在1974年大范围爆发引起蜂群崩溃的SBV在越夏期的检测率仅为7.35%(Maetal., 2015; Yadavetal., 2017)。BQCV也未在越夏期出现，而BQCV的出现和传播常与微孢子虫Microsporidia有关(Baileyetal., 1983)，所以是否SINV、SBV、ALPV、BQCV与微孢子虫的传播或潜伏有关，还是与贵州省当地的气候变化或地理环境有关，此问题还需进一步调查。另外，广泛流行的DWV也仅在越冬期出现，且出现频率不高。狄斯瓦螨Varroadestructor是传播DWV的媒介，DWV一般是以隐性感染存在于蜂群中，染螨率较低的蜂群中DWV的病毒量也较低，而一旦蜂群的瓦螨载量较高，即使通过人为治螨等手段也抑制不住DWV的滴度持续上升(Francisetal., 2013)，狄斯瓦螨可以促进DWV的复制与传播，同时也会降低它的毒株多样性，使得优势毒株在蜂群内越来越逐渐普遍，导致蜂群崩溃的几率大大增加(Martinetal., 2012)，在此次检测的贵州蜂样中，DWV的感染频率较低，可能与贵州当地的温度和湿度有关，或许还有其它原因，此问题还需进行后续试验来佐证。本研究首次报道了贵州省不同季节蜜蜂病毒的发生情况，在一定程度上为贵州省蜜蜂主要病毒病的防治提供了理论依据。