阿胶活性肽的结构鉴定及活性筛选

王莹雪，樊雨梅，廖 峰，于志鹏

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121013；2.国家胶类中药工程技术研究中心，东阿阿胶股份有限公司，山东 聊城 252201；3.海南大学食品科学与工程学院，海南 海口 570228）

阿胶是采用马科动物驴的鲜皮或干皮经去毛漂泡、煎煮、浓缩，并加入冰糖、豆油等辅料制成的固体胶，也被称为驴皮胶，主要成分是胶原蛋白、多肽和硫酸皮肤素，其中蛋白质含量较高约为60%～80%。阿胶具有补血止血、增强免疫、抗疲劳、抗衰老、抑制肿瘤、促进骨愈合和滋阴润肺等作用。现代药理研究表明阿胶可能对白血病K562细胞和肺癌PG细胞等癌细胞的生长具有抑制作用，可以抑制荷瘤S180肉瘤小鼠体内的肿瘤生长并延长模型小鼠的存活时间。体外细胞实验证明阿胶酶解物对阿尔兹海默症（老年痴呆症）具有改善作用，抑制了神经元样PC12细胞中的乙酰胆碱酯酶（acetyl cholinesterase，AChE）活性，阻止了过氧化氢诱导的AChE异常恶化，提高了淀粉样蛋白的清除率。

阿胶发挥主要功效的组分以多肽和蛋白质为主，尤其酶解后的小分子阿胶肽分子质量在1 000 Da以下，分子质量的降低使阿胶具有较好的溶解性，更容易被机体消化吸收，减轻了阿胶的滋腻性，提高了阿胶的生物利用率。另外，樊雨梅等证明了阿胶低聚肽清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基和减轻HO诱导的成纤维细胞氧化损伤的效果优于阿胶。因此，从分子质量低于1 000 Da的阿胶多肽中筛选降压肽、抗老年痴呆肽和抗肿瘤肽等活性肽具有重要的商业价值和应用前景。

本研究利用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术分离鉴定阿胶模拟胃肠道消化产物中活性肽的结构，重点围绕六肽、七肽和八肽与受体靶标进行分子对接，筛选具有降血压、抗肿瘤和抗老年痴呆活性的阿胶肽。本研究将有助于揭示阿胶发挥多种生物活性的组分及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阿胶（批号：1502004） 东阿阿胶股份有限公司。

纯水、乙腈、甲酸、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（均为质谱纯） 美国Fisher Scientific公司；碳酸氢铵（生化纯） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

10 kDa超滤管（Amicon ultra,Centrigµgal Filter） 德国Merck Millipore公司；EASY-nLC 1000超高压纳升级液相色谱仪、Orbitrap Fusion质谱仪、纳升级肽段分析柱（Acclaim PepMap C，75 µm×250 mm） 美国Thermo Scientific公司；alpha1-2LD冷冻干燥机 德国Christ公司；制冰机 日本松下公司；sep-Pak C除盐柱（100 mg） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 消化液的配制

根据2015版《中国药典》规定的方法，取5 mL盐酸（12 mol/L）加水至19 mL配制成稀盐酸，取0.82 mL稀盐酸，加约40 mL水和0.5 g胃蛋白酶，摇匀使其充分溶解，调节pH值至1.3，加水定容至50 mL，制成人工胃液。取0.34 g磷酸二氢钾，加25 mL水使其溶解，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，另外称取0.5 g胰蛋白酶加适量水溶解，两液混合后，加水定容至50 mL，制成人工肠液。

1.3.2 阿胶胃肠道消化产物的制备

取2 g阿胶粉末溶于50 mL 60 ℃热水中，称取10 mL放入圆底烧瓶中，加入10 mL人工胃液，封口，置于37 ℃恒温振荡水浴锅内水浴2 h。胃液消化结束后，用1 mol/L NaOH溶液调节pH值至6.8，加入20 mL人工肠液，继续恒温搅拌4 h。消化结束后，将混合溶液进行冷冻干燥，收集固体粉末避光保存。

1.3.3 阿胶活性肽的分离

取120 mg模拟胃肠道消化后的阿胶固体粉末溶于1 mL 1%甲酸溶液中，冰上超声10 min使其充分裂解。随后4 ℃、20 000×离心30 min取上清液。吸取400 µL上清液使用10 kDa超滤管超滤（10 000×）至40 µL，收集滤液得到阿胶活性肽溶液。

1.3.4 阿胶活性肽的除盐

首先用含0.1% TFA和80%乙腈的水溶液200 µL活化除盐柱，再用含0.1% TFA和1%乙腈的水溶液400～600 µL平衡除盐柱。将阿胶活性肽溶液缓慢流过平衡后的除盐柱收集多肽，盐等其他非疏水性小分子流出。加入含0.1% TFA和0.5%乙腈的水溶液200 µL清洗除盐柱，洗去残留盐类。最后，用含0.1% TFA和80%乙腈的水溶液300 µL将除盐柱中的多肽洗脱下来，洗脱液收集到EP管中冷冻干燥。

1.3.5 阿胶活性肽的LC-MS/MS分析

1.3.5.1 LC条件

流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸-乙腈溶液。进样量2 µL，上样流速500 nL/min，分离流速300 nL/min。梯度洗脱条件：0～105 min，95%～70% A、5%～30% B；105～110 min，70%～10% A、30%～90% B；110～112 min，10% A、90% B；112～113 min，10%～95% A、90%～5% B；95% A、5% B保持7 min。

1.3.5.2 MS条件

离子源喷雾电压2.2 k V，加热毛细管温度320 ℃，在MS和MS/MS间切换采集。全扫描MS：扫描范围/400～1600，扫描分辨率120000（/200处），离子最大引入时间50 ms，自动增益控制（automatic gain control，AGC）设定为1.0×10。MS/MS：扫描分辨率15 000，扫描范围/110～2 000，最低离子强度50 000，离子最大引入时间100 ms，AGC设定为1.0×10，母离子选择设定为1.6 Da。

1.3.6 Proteome Discoverer软件搜库定性分析

通过Proteome Discoverer（version 2.4.0.305）软件应用Sequest HT搜索引擎对质谱原始文件（raw文件）进行搜索。检索参数：无固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸氧化、蛋白N端乙酰化；一级质谱精度1.0×10，二级质谱精度0.02 Da；Uniprot数据库Equus asinus（Mnemonic:EQUAS）种属；肽段及蛋白假阳性率≤1%；肽段最少包含6 个氨基酸。

1.3.7 阿胶源活性肽的活性筛选

通过RCSB PDB数据库获得降血压靶标血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE），抗老年痴呆靶标AChE、丁酰胆碱酯酶（butyrylcholinesterase，BChE）、-淀粉样前体蛋白裂解酶1（-site amyloid precursor protein cleavage enzyme 1，BACE1）和抗肿瘤靶标氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）的X射线晶体结构。通过Discovery Studio（DS）2017 R2（Dassault Systemes Biovia,San Diego,CA,USA）软件对受体靶标去除水分子、添加氢原子后，在“Receptor-Ligand Interactions”模块中定义其活性中心，活性中心（,,）及对接半径（）信息见表1。通过DS软件的“Macromolecules”模块绘制肽的结构，利用“Minimize Ligands”和“Prepare Ligands”工具在CHARMm力场下对肽的结构进行能量优化。通过“Receptor-Ligand Interactions”模块的“CDOCKER”工具对受体和肽进行分子对接，根据－CDOCKER_Energy值分别筛选潜在降血压、抗老年痴呆和抗肿瘤效果较好的活性肽。

表1 受体靶标的活性中心及对接半径Table 1 Active centers and docking radia of receptor targets

2 结果与分析

2.1 阿胶模拟胃肠道消化产物中活性肽的结构鉴定

对阿胶模拟胃肠道消化产物中的活性肽进行质谱分析和搜库定性分析。结果显示，全部谱图数为65 813 个，数据库中能匹配到的谱图数有2 015 个，共鉴定到519 种阿胶活性肽。MS分析结果显示，检测到的肽段氨基酸数目在6～33 个之间，分子质量分布在661.4～2 851.4 Da之间，共来源于8 种蛋白，大部分肽段是驴源胶原蛋白和血红蛋白的酶解产物。其中有248 种肽来自驴源I型胶原蛋白-1链（138.9 kDa），有198 种肽来自驴源I型胶原蛋白-2链（128.6 kDa），有43 种肽来自驴源血红蛋白亚基（15.2 kDa），有23 种肽来自驴源血红蛋白链（16 kDa），有3 种肽来自驴源巨噬细胞移动抑制因子（12.4 kDa），有1 种肽来自驴源细胞色素C氧化酶亚基II（26 kDa），有1 种肽来自驴源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（片段）（8.8 kDa），还有2 种肽来自驴源白蛋白（68.5 kDa）。肽匹配图谱（peptidespectrum matches，PSMs）值越大表示肽段在阿胶中的相对含量越高，PSMs≥21的肽段共有13 个，其氨基酸序列、PSMs、分子质量及其所属蛋白的检测信息见表2。可见相对含量最高的肽段是ISVPGPMGPSGPR（甲硫氨酸氧化修饰），其次为SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR和ISVPGPMGPSGPR，这3 种肽段是阿胶多肽中的主要肽段，其二级谱图见图1。

表2 消化后的阿胶活性肽的质谱鉴定结果Table 2 Mass spectrometric identification of active peptides from digested Ejiao

图1 ISVPGPMGPSGPR（甲硫氨酸氧化修饰）（a）、SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR（b）和ISVPGPMGPSGPR（c）的二级谱图Fig.1 Secondary mass spectra of ISVPGPMGPSGPR(1×Oxidation[M7]) (a),SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR (b),and ISVPGPMGPSGPR (c)

SGQPGTVGPAGVR是马科动物（马、驴及其杂种）皮相比于牛皮和猪皮所特有的标记肽，在本研究中被鉴定出来；GASGPAGVR是马和杂种相比于驴的皮中所特有的标记肽，在本研究中没有被鉴定出来，与先前的研究一致。阿胶消化后的活性肽中含有苏氨酸（Thr）、缬氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）和色氨酸（Trp）8 种人体必需氨基酸，与前人的研究一致。多肽的疏水性有助于增强其抗氧化特性，多肽中疏水性氨基酸含量越高，其抗氧化作用越强。在519 种阿胶活性肽中，有515 种肽含有Phe、Val、Leu、Ile、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、Trp和Met中的一种或几种，这些疏水性氨基酸有可能增强阿胶的抗氧化能力。

2.2 阿胶源活性肽的ACE抑制活性的筛选

在55 个六肽、七肽和八肽中，有42 个阿胶活性肽可与降血压靶标ACE发生不同程度的结合，具有潜在的ACE抑制活性。对接结果中的－CDOCKER_Energy值代表受体与配体之间的结合亲和力，该值越高则表示受体与配体的结合亲和力越高，即结合得越容易、越紧密。与ACE结合的－CDOCKER_Energy值最高的3 个肽依次为KGETGLR（193.40 kcal/mol）、TGEQGDR（176.23 kcal/mol）和VQLSGEEK（172.73 kcal/mol），可以作为ACE抑制剂的候选物，其中KGETGLR是最具潜力的降压肽，其与ACE的相互作用见图2。ACE主要有3 个活性口袋：S1（Ala354、Glu384和Tyr523）、S2（Gln281、His353、His513、Lys511和Tyr520）和S1’（Glu162）。KGETGLR、TGEQGDR和VQLSGEEK均通过吸引电荷和氢键相互作用与ACE残基Glu376和Asp377结合并形成盐桥，通过氢键相互作用与ACE残基His353、Glu384、Gln281和Ala356结合。因此，残基His353、Glu384和Gln281是促使阿胶肽与受体ACE紧密结合的关键氨基酸，氢键相互作用和静电相互作用（盐桥、吸引电荷相互作用）在阿胶肽与ACE的结合中起着关键作用，与文献报道的研究结论相似。

图2 KGETGLR-ACE相互作用2D图（a）和3D图（b）Fig.2 Two-dimensional (a) and 3D diagram (b) of the interaction between KGETGLR and ACE

2.3 阿胶源活性肽的抗老年痴呆活性的筛选

在5 5 个六肽、七肽和八肽与抗老年痴呆靶标AChE、BChE和BACE1的分子对接结果中，有23 个肽与受体AChE对接成功，有41 个肽与受体BACE1对接成功，其中22 个均可与AChE和BACE1发生不同程度结合的阿胶活性肽具有抗老年痴呆活性的可能性更大。在这22 个多肽中，SGLDGAKG、NGLTGAK和GNIGPAGK是与AChE和BACE1 结合的－CDOCKER_Energy 值综合 最高的3 个肽，其与A ChE 结合的－CDOCKER_Energy值分别是143.17、126.23 kcal/mol和124.79 kcal/mol，与BACE1结合的－CDOCKER_Energy 值分别是134.24、129.11kcal/mol和111.38 kcal/mol，可以作为抗老年痴呆药物的候选物。其中SGLDGAKG是最具潜力的抗老年痴呆肽，其与AChE和BACE1的相互作用分别见图3、4。

图3 SGLDGAKG-AChE相互作用2D图（a）和3D图（b）Fig.3 Two-dimensional (a) and 3D diagram (b) of the interaction between SGLDGAKG and AchE

AChE的活性中心包括外围阴离子位点（Tyr70、Asp72、Tyr121、Trp279、Tyr334）和催化位点（Trp84、Gly118、Gly119、Ala201、Tyr130、His440、Ser200、Glu327、Tyr330、Phe331），其中芳香族残基Trp279和Trp84发挥关键作用。SGLDGAKG、NGLTGAK和GNIGPAGK均通过吸引电荷和氢键相互作用与AChE残基Glu199结合并形成盐桥，通过氢键相互作用与AChE残基Tyr121结合；另外，SGLDGAKG通过π-烷基与A ChE 残基Trp 279 结 合，NGLTGAK 和GNIGPAGK均通过π-阳离子与AChE残基Trp84结合。因此，Tyr121、Trp279和Trp84是促使阿胶肽与受体AChE紧密结合的关键氨基酸，氢键相互作用和静电相互作用（盐桥、吸引电荷相互作用、π-阳离子）在阿胶肽与AChE的结合中起着关键作用，与文献报道的研究结论相似。

已有研究表明，Asp32和Asp228是BACE1的活性催化中心。SGLDGAKG、NGLTGAK和GNIGPAGK均通过吸引电荷相互作用与BACE1残基Lys321结合并形成盐桥，通过吸引电荷和氢键相互作用与BACE1残基Asp228结合并形成盐桥，通过氢键相互作用与BACE1残基Thr231和Gly230结合。另外，残基Asp32可通过氢键相互作用与SGLDGAKG结合，通过吸引电荷和氢键相互作用与NGLTGAK结合并形成盐桥，但并未与GNIGPAGK产生相互作用，这可能是GNIGPAGK与BACE1结合的－CDOCKER_Energy值比SGLDGAKG和NGLTGAK小的原因。因此，残基Lys321、Asp228、Thr231、Gly230和Asp32可能在阿胶肽与受体BACE1的紧密结合中起着重要作用，同样氢键相互作用和静电相互作用（盐桥、吸引电荷相互作用）是阿胶肽与BACE1结合的主要作用力，与文献报道的结论相似。

图4 SGLDGAKG-BACE1相互作用2D图（a）和3D图（b）Fig.4 Two-dimensional (a) and 3D diagram (b) of the interaction between SGLDGAKG and BACE1

2.4 阿胶源活性肽的抗肿瘤活性的筛选

在55 个六肽、七肽和八肽中，有10 个阿胶活性肽可与抗肿瘤靶标APN发生不同程度的结合，分别是ANGLTGAK（146.52 kcal/mol）、TGEQGDR（144.63 kcal/mol）、NGLTGAK（132.21 kcal/mol）、ADGVAGPK（123.17 kcal/mol）、MGLMGPR（107.10 kcal/mol）、PAGPTGAR（103.43 kcal/mol）、ASGPAGPR（99.50kcal/mol）、PQGVQGGK（89.95 kcal/mol）、PAGPAGPR（78.39 kcal/mol）和ASGPMGPR（75.25 kcal/mol），具有潜在的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的候选物。

APN的活性位点由3 个口袋组成：S1（Glu355、His388）、S1’（Glu411、His392、Tyr477）和S2’。虽然ANGLTGAK、TGEQGDR和NGLTGAK与APN结合的－CDOCKER_Energy值最高，但是ANGLTGAK与残基Arg381和His388发生不利的供体-供体冲突，TGEQGDR与残基Glu411发生不利的受体-受体冲突，NGLTGAK仅与APN活性口袋中的残基Glu355和Glu411产生吸引电荷相互作用和形成盐桥。而ADGVAGPK不仅可与APN活性口袋中的残基Glu355和Glu411产生吸引电荷相互作用和形成盐桥，与APN活性口袋中的残基His388和Tyr477产生π-烷基相互作用，另外还可与APN残基Glu389产生吸引电荷相互作用并形成盐桥，与APN残基Arg381、Ala351、Gly352、Gln213、Ala353、Met354、Asn350、Asn900、Ser895和Ser897产生氢键相互作用（图5）。因此，ADGVAGPK是阿胶模拟胃肠道消化产物中最具潜力的抗肿瘤肽，残基Glu355、Glu411、His388和Tyr477是促使阿胶肽与受体APN紧密结合的关键氨基酸，同样氢键相互作用、静电相互作用（盐桥、吸引电荷相互作用）和疏水相互作用（π-烷基）在阿胶肽与APN的结合中起着关键作用，与文献报道的研究结论相似。

图5 ADGVAGPK-APN相互作用2D图（a）和3D图（b）Fig.5 Two-dimensional (a) and 3D diagram (b) of the interaction between ADGVAGPK and APN

3 结论

本研究利用LC-MS/MS技术从阿胶模拟胃肠道消化产物中分离鉴定出519 种活性肽，其分子质量均分布在661.4～2 851.4 Da之间，富含人体必需氨基酸和疏水性氨基酸，大多来源于驴源胶原蛋白和血红蛋白，其中相对含量最高的肽段是ISVPGPMGPSGPR。利用分子对接技术对阿胶模拟消化产物中的六肽、七肽和八肽进行活性筛选，筛选出了最具潜力的降压肽KGETGLR、抗老年痴呆肽SGLDGAKG和抗肿瘤肽ADGVAGPK。氢键相互作用和静电相互作用（盐桥、吸引电荷相互作用）在阿胶多肽的降血压、抗老年痴呆和抗肿瘤活性中都起着至关重要的作用。本研究为开发阿胶肽粉、阿胶肽膏、阿胶多肽含片、阿胶多肽胶囊、阿胶多肽冲剂、阿胶多肽口服液等一系列具有降血压、抗老年痴呆和抗肿瘤功效的阿胶活性肽保健品提供了理论依据。