营养不良对γ-干扰素释放试验检测结核病阳性率的影响

拉巴 张蒙蒙 王明桂 贺建清

【Fundprogram】 The National Natural Science Foundation of China Grants (81870015)

早期准确诊断和治疗结核病是“终止结核病战略”的重要措施[1-2]。目前，诊断结核病主要依赖于抗酸杆菌涂片镜检、分枝杆菌培养、结核分枝杆菌核酸检测以及组织病理等病原学检查，但即使结合了多种检测手段，全球肺结核的确诊率仍不足60%[1]，在低收入及资源有限的地区甚至更低。这就意味着结核抗体、结核菌素皮肤试验以及γ-干扰素(IFN-γ)释放试验(interferon gamma release assays，IGRA)等在内的免疫学检测可能在临床诊断中发挥重要作用[1, 3-5]。尤其是近几年发现，IGRA检测试剂盒可以克服结核菌素皮肤试验的一些假阳性率及测量误差等局限性[6]，已被广泛应用于结核病的早期辅助诊断和监测中[1, 3-5]，但该方法的诊断价值在机体免疫功能受到抑制时可能会受到影响。

营养不良是结核病的危险因素，而结核病作为一种消耗性疾病，又会加重营养不良[7-8]。研究显示，IGRA检测结果的不确定性和低水平的IFN-γ浓度均与营养不良相关[9]。有学者在低体质量指数(BMI)的结核分枝杆菌潜伏感染者(latent tuberculosis infection, LTBI)中发现多种重要趋化因子水平降低[10]，但目前尚无探讨营养不良对IGRA检测结核病结果影响的报道。因此，笔者拟通过对不同营养状态结核病患者的IGRA检测结果进行分析，以评价营养状态是否会影响结核病患者的IGRA检测结果。

资料和方法

1.研究对象：采用回顾性研究的方法，纳入2015年1月至2018年11月于四川大学华西医院呼吸与危重症医学科符合入组标准的443例住院结核病患者作为研究对象，收集患者的性别、年龄、身高、体质量、吸烟史、饮酒史、病原学检测结果(包括抗酸杆菌涂片镜检、分枝杆菌培养、病理学检测、结核DNA检测)、IGRA、外周血淋巴细胞和T淋巴细胞亚群等临床资料。

按照BMI数值，将患者分为营养不良组(BMI<18.5)和非营养不良组(BMI≥18.5)。其中，营养不良组136例，包括男性90例，女性46例，中位年龄为29.0(20.0,49.0)岁；非营养不良组307例，包括男性161例，女性146例，中位年龄为39.0(27.0，52.0)岁。 两组患者在性别、年龄、身高、体质量和病原学检测任一阳性的差异均有统计学意义，在其他方面的差异均无统计学意义，具体见表1。

表1 结核病患者一般特征在两组患者中的分布情况

2.入组标准：剔除临床资料不全者后，纳入结核分枝杆菌培养阳性、病理组织检查阳性、结核DNA检测任一阳性者(病原学确诊)；排除其他肺部疾病后纳入符合结核病影像学表现，并至少有肺结核可疑症状、结核菌素皮肤试验中等及以上阳性、IGRA阳性、结核抗体阳性、抗结核药物治疗有效之一者(临床诊断病例)。

3.IGRA检测：本研究使用QuantiFERON-TB-Gold-In-tube(QFT-GIT)检测技术，采用TB-IGRA检测试剂(北京万泰生物药业股份有限公司生产，生产批号：TR20141207-TR20181010A)按照说明书进行检测。(1)标本采集与处理：采用肝素抗凝真空采血管采集患者外周静脉全血4～6 ml。2 h内将全血标本分装到N(本底对照管)、T(测试管，即结核抗原管)、P(阳性对照管，即促有丝分裂因子管)，37 ℃培养20～24 h，3000 r/min离心10 min(离心半径为20 cm)后收集上清液，检测上清液中IFN-γ含量。(2)结果判定：本底对照管及阳性对照管用于判断检测的有效性；以校准品的抗原含量(12.5～400 pg/ml)及其对应的吸光度值制作标准曲线，求出线性回归方程，P管含量值为阳性对照值，IGRA绝对值为T管含量值与N管含量值的差值(T-N)，当T-N≥14.0且≥N/4则判定为检测结果阳性。

4.外周血淋巴细胞检测：考虑到IGRA是免疫学检测方法，营养不良可能会影响外周血淋巴细胞数据，故研究进一步比较两组患者不同IGRA检测结果中的外周血淋巴细胞计数和T淋巴细胞亚群分布情况。

采用美国BD公司的FACSCount流式细胞计数仪、Truecount计数管和FACS溶血素进行T细胞计数，所有试剂均在有效期内按说明书使用。Immuno-Trol质控血同检测标本一同进行操作，在流式细胞检测的试管中加20 μl CD4荧光标记抗体，然后加入混匀的抗凝血50 μl，室温避光孵育15 min。在标本中加入溶血素，室温避光孵育15 min 后上机检测，上机前应用CaliBRITETM磁珠及FACSCompTM软件校准流式细胞仪，将制备好的样本上机，使用MultiSETTM软件获取并自动分析检测结果。

5.统计学处理：使用Excel 2016软件建立数据库并进行双录入。采用SPSS 21.0软件进行数据分析。本研究计量资料均呈偏态分布，采用“中位数(四分位数)[M(Q1,Q3)]”描述，组间差异的比较采用秩和检验；计数资料以“构成比/百分率(%)”描述，组间差异的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.IGRA检测结果：IGRA检测阳性率在两组患者中的差异无统计学意义，且检测两组患者中病原学阳性患者阳性率的差异也无统计学意义。具体见表2。

表2 IGRA结果在两组患者中的分布情况

2.外周血淋巴细胞计数及T淋巴细胞亚群检查结果：本研究中有T淋巴亚群检查结果的结核病患者共计344例，其中，营养不良组118例，对照组226例。结果显示，外周血淋巴细胞计数及T淋巴细胞亚群分布在两组所有患者间差异均无统计学意义(P值均>0.05)，并且在营养不良患者中IGRA阳性与IGRA阴性患者间的分布差异也均无统计学意义(P值均>0.05)。具体见表3、4。

表3 淋巴细胞及T淋巴细胞亚群在两组患者中的检测水平

讨 论

结核病是一种慢性消耗性传染病，常伴有营养不良的表现。本研究根据BMI值将443例结核病患者分为营养不良组(BMI<18.5)和非营养不良组(BMI≥18.5)，发现IGRA检测营养不良结核病患者的阳性率与非营养不良患者差异无统计学意义，且在病原学阳性结核病患者亚组分析中阳性率的差异也无统计学意义，这提示IGRA检测可以推荐用于营养不良患者结核病的辅助诊断。

表4 淋巴细胞及T淋巴细胞亚群在IGRA阳性与阴性营养不良结核病患者中的检测水平

传统的结核感染筛查方法如结核菌素皮肤试验等应用广泛，但敏感度和特异度均较低。而QFT-GIT是通过酶联免疫吸附法在体外测定结核特异性抗原刺激新鲜肝素化全血中IFN-γ的浓度来判断患者是否感染结核分枝杆菌，在早期的研究中就显示出其诊断结核感染的敏感度约为80%[4]，已成为当前运用较为成熟的检测方法。本研究使用该技术的检测结果显示，营养不良及非营养不良结核病患者的阳性检出率分别为76.47%和78.18%，且在病原学阳性结核病患者中的阳性率分别为75.61%和80.65%，这说明QFT-GIT对不同营养状态下结核病患者的检测结果具有较好的一致性。而且，本研究结果高于另一研究中IGRA在营养不良结核病患儿中诊断结核病的阳性率(69.6%)，该研究共计纳入86例疑似结核病患儿[11]，提示QFT-GIT对成年人的阳性检出率较高，可能与儿童免疫系统发育不完全有关。另外，一项纳入1928例疑似结核病患者的研究指出，高BMI可能与TB-IGRA检测的假阴性相关[12]，但并未指出营养不良即低BMI与IGRA检测结核病患者的不良结果相关。

结核分枝杆菌感染人体后，机体对结核分枝杆菌的抵抗是由特异性T淋巴细胞介导的细胞免疫。在T细胞亚群中，CD4+T细胞和CD8+T细胞是机体针对结核分枝杆菌的细胞免疫应答中的主要细胞[13]，与外周血淋巴细胞呈线性相关，CD4+T细胞是产生IFN-γ的主要细胞，少量的CD8+T细胞也诱导产生IFN-γ[14]。QFT-GIT检测法可通过诱导CD4+T细胞免疫应答来检测结核分枝杆菌感染情况，其检测结果与CD4+T细胞和CD8+T细胞计数密切相关。一项Meta分析显示，外周血淋巴细胞计数低可能是IGRA假阴性的常见危险因素[15]；另一项研究发现，当患者在使用免疫抑制药物或合并HIV感染等情况时，其免疫功能极易受损，从而出现免疫缺陷，导致T细胞无法充分产生IFN-γ，可能降低IGRA检测的阳性率[16]。故建议对于需要筛查的结核病高危人群，在进行TB-IGRA 检测的同时应完善淋巴细胞亚型的分析[17]。另外，严重营养不良或饥饿也可以通过影响T细胞的存活和增殖来改变T细胞数量。有研究将禁食48 h后的小鼠与正常喂养的小鼠进行对比，发现被禁食小鼠的胸腺细胞数明显下降[18]；另有研究在营养不良的细菌感染患儿中发现，CD4+和CD8+T细胞计数明显低于正常体质量的细菌感染的患儿[19]。本研究显示，外周血淋巴细胞计数及T细胞亚群在营养不良及非营养不良结核病患者中的差异均无统计学意义，说明在本研究中营养不良并未影响到淋巴细胞计数及T淋巴细胞亚群的分布，这可能与本研究纳入的研究者均为免疫系统已经发育完全的成年人有关，这也可能是两组患者中IGRA检测结果未受到影响的原因。

与本研究结果类似，糖尿病患者虽然有免疫功能异常，但Walsh等[20]发现IGRA并未降低合并结核病的糖尿病患者的阳性检出率，提示IGRA不仅可以用于糖尿病患者结核感染的诊断，也可以用于LTBI者的检测。同理，本研究得出的结论也可延伸到LTBI人群，即IGRA诊断营养不良人群中LTBI者的敏感度不会降低，这可能与结核病患者容易发展成结核分枝杆菌特异性免疫无能，使IGRA检测敏感度下降[21-23]，而在营养不良的LTBI者中并无此类免疫无能发生有关。因此，IGRA对于诊断营养不良患者结核分枝杆菌潜伏感染的敏感度应与IGRA辅助诊断营养不良疑似结核病患者的敏感度相当或者更好。因此，IGRA用于诊断营养不良患者中LTBI与其他人群同样可靠，但该推断需要在营养不良和非营养不良LTBI者中进行研究确定。

综上所述，营养不良并不会影响不同营养状态下IGRA检测结核病的阳性率，提示IGRA在营养不良的结核病患者中具有与其他人群同样的辅助诊断价值，并有可能适用于营养不良人群中LTBI者的筛查。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献拉巴：实验设计、数据的采集与整理、初稿撰写；张蒙蒙和王明桂：数据分析及初稿撰写；贺建清：主导整个课题设计及论文初稿修改