弩药液的镇痛作用及对炎性疼痛因子TNF-α、IL-6和PGE2的影响

梁潇 刘娇 胡涛 阮婧华 钱海兵

【摘 要】 目的：研究苗藥制剂弩药液的镇痛作用及作用机制，为弩药液的临床应用提供药理学基础。方法：采用小鼠热板实验，雄性ICR小鼠40只，随机分为模型组，弩药液高、中、低剂量组，每组10只，连续7d腹部涂抹给药后测定末次给药后小鼠30min、60min、90min痛阈值;采用小鼠扭体实验，ICR小鼠50只，雌雄各半，随机分为模型组，弩药液高、中、低剂量组，纳络酮+高剂量组，每组10只，连续7d腹部涂抹给药后腹腔注射0.8%冰醋酸生理盐水溶液，随即记录小鼠扭体潜伏期和15min内扭体次数;采用大鼠福尔马林致痛实验，SD大鼠30只，雌雄各半，随机分为空白组，模型组，弩药液高、中、低剂量组，每组6只，连续7d腹部涂抹给药后于大鼠右足底皮下注射5%福尔马林生理盐水溶液，随即记录大鼠第一时相和第二时相舔咬后足持续时间，并且检测大鼠血清炎性疼痛因子TNF-α、IL-6和PGE2浓度。结果：热板实验中，小鼠给药后30min和60min高剂量组与模型组以及高剂量组给药后60min和90min与给药后30min痛阈值比较，均有显著性差异（P<0.05）;扭体实验中，模型组、低剂量组及纳络酮+高剂量组与高剂量组潜伏期及扭体次数比较均有显著性差异（P<0.05）;福尔马林致痛实验中，各组大鼠舔咬后足持续时间第一时相无显著性差异（P>0.05），高、中剂量组与模型组舔咬后足持续时间第二时相比较，有显著性差异（P<0.05），空白组、高剂量组和中剂量组大鼠血清IL-6、PGE2浓度均与模型组比较，有显著性差异（P<0.05），空白组血清TNF-α浓度与模型组比较，有显著性差异（P<0.05），给药组血清TNF-α浓度较模型组有所降低，但无显著性差异（P>0.05）。结论：弩药液对多种疼痛模型具有显著镇痛作用，可能作用于阿片类受体，作用机制可能与显著下调炎性疼痛因子IL-6、PGE2有关。

【关键词】 苗药制剂;弩药液;镇痛作用

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2022）13-0017-04

Analgesic Effect of Crossbow Liquid and its Effect on Inflammatory Pain Factors TNF-α， IL-6 and PGE2

LIANG Xiao1 LIU Jiao1 HU Tao1 RUAN Jinghua2 QIAN Haibing1*

1.Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025，China;2.First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550001，China

Abstract：Objective To study the analgesic effect and possible mechanism of Nuyaoye， miao medicine preparation， to provide pharmacological basis for clinical application of Nuyaoye.Methods Forty Female ICR mice were randomly divided into model group， high-dose， medium-dose and low-dose groups with 10 mice in each group. The pain threshold of 30min，60min and 90min after the last administration was measured after 7 days of abdominal smear.A total of 50 ICR mice （Male and female half） were randomly divided into model group， high-dose， medium-dose and low-dose naloxone + high-dose groups， with 10 mice in each group. After 7 days of abdominal administration，0.8% glacial acetic acid normal saline solution was intraperitoneally injected. The latency period of writhing and the number of writhing within 15 minutes were recorded.Using rats foer Ma Linzhi pain experiment， 30 SD rats（Male and female half） were randomly divided into blank group， model group， crossbows， solution of high， middle， low dose group， each group of six， seven d rats after abdominal daub to right plantar subcutaneous injection of 5% formalin saline solution， then record first and 2 in the first phase of rats lick bite after sufficient duration， Serum concentrations of inflammatory pain factors TNF-α， IL-6 and PGE2 were detected.Results In the hot plate experiment， there were significant differences between the pain threshold of the high-dose group and the model group 30min and 60min after administration， and the pain threshold of the high-dose group 60min and 90min after administration and 30min after administration （P<0.05）. In the writhing experiment， there were significant differences in latency and writhing times between the model group， low-dose group， naloxone + high-dose group and high-dose group （P<0.05）. In the formalin-induced pain experiment， there was no significant difference in the first phase of the licking hind foot duration among all groups （P>0.05）， but there was a significant difference in the second phase of the licking hind foot duration between the high-dose and medium-dose groups and the model group （P<0.05）. The serum concentrations of IL-6 and PGE2 in blank group， high-dose group and medium-dose group were significantly different from those in model group （P<0.05）. The serum concentrations of TNF-α in blank group were significantly different from those in model group （P<0.05）. The serum concentrations of TNF-α in administration group were decreased compared with that in model group， but there was no significant difference （P>0.05）.Conclusion The miaoyao preparation Nuyaoye has significant analgesic effects on various pain models， which may act on opioid receptors， and the mechanism of action may be related to the significant down-regulation of inflammatory pain factors IL-6 and PGE2.

Key words：Miaoyao Preparation;Nuyaoye;Analgesic

国际疼痛研究学会将疼痛定义为“一种与实际或潜在组织损伤相关的感觉、情感、认知和社会维度的痛苦体验”[1]，疼痛反应严重影响患者的生活。我国民族药药物资源丰富，且有多种镇痛药物及制剂应用于临床并取得显著的效果，从传统药物中寻找副作用小且镇痛效果显著的药物已成为当前研究热点。苗药弩药液为外用制剂，具有活血化瘀-祛风止痛的功效，临床用于骨关节炎、类风湿等引起的关节疼痛，亦可用于癌性疼痛辅助治疗，主要由大血藤、飞龙掌血、透骨香、白屈菜和黑骨藤组方而成，实验研究[2-6]表明，以上药物对多种疼痛模型均具有显著镇痛作用。

本研究采用热板实验、醋酸扭体实验和福尔马林致痛实验，以行为学和血清疼痛因子水平为指标，研究弩药液的镇痛作用以及可能的作用受体及机制，旨在阐明弩药液对不同疼痛模型的作用，为其临床应用提供药理学实验基础。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物 ICR小鼠（雌性75，雄性25），体质量（20±2）g;SD大鼠（雌性15，雄性15），体质量（200±20）g。所有动物购于长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0014，适应性喂养7d后参照文献[7-8]进行实验。

1.2 药物及试剂 弩药液由贵州中医药大学第一附属医院提供，取原液为高剂量、稀释一倍为中剂量、稀释两倍为低剂量;纳络酮（批号：MB5693，大连美仑生物技术有限公司），配制成5mg/kg的纳络酮生理盐水溶液;福尔马林（批号：20170204，重庆江川化工集团有限公司），配制成5%福尔马林生理盐水溶液;冰醋酸（批号：20190221，国药集团化学试剂有限公司），配制成0.8%冰醋酸生理盐水溶液;大鼠IL-6（Interleukin 6，批号：KKSX3XLXAQ）、TNF-α（Tumor Necrosis Factor Alpha，批号：CFDS7MDM1E）、PGE2（Prostaglandin E2，批号：F21MQ8N8J6）ELISA试剂盒。

1.3 仪器 热板测痛仪（由贵州中医药大学提供）、JJ224BF型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂，编号：W162419080116）、80-1医用离心机（江苏新康医疗器械有限公司）、Infinite M200酶标仪（北京新风机电技术公司）。

1.4 小鼠热板舔足实验 雌性ICR小鼠50只，置于55℃热板测痛仪上，以小鼠初次舔咬后足反应潜伏期为痛阈指标即痛阈值（s），间隔20min测定两次，取平均值作为基础痛阈值，随机选择40只基础痛阈值在5～30s内且无跳跃反应小鼠进入实验，随机分为模型组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组10只。小鼠腹部以给药面积1.5cm2备皮，模型组涂抹生理盐水，高、中、低剂量组分别均匀涂抹相应药物，2次/d，连续7d，末次给药后30min、60min、90min各组小鼠分别测定痛阈值（s），计算痛阈提高百分率=（给药后痛阈值-基础痛阈值）×100%/基础痛阈值。

1.5 小鼠纳络酮拮抗-醋酸扭体实验 ICR小鼠50只，雌雄各半，随机分为模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、纳络酮+高剂量组，每组10只。除模型组外，其余各组按1.3项下方法给药，末次给药后45min，除纳络酮+高剂量组腹腔注射纳络酮溶液（5mg/kg，0.1mL/10g）外，其余各组均腹腔注射生理盐水（0.2mL/只），15min后，模型组和纳络酮组涂抹生理盐水，其余各组分别涂抹相应药物，40min后各组均腹腔注射0.8%冰醋酸生理盐水溶液（0.1mL/10g），立即观察并记录各组小鼠初次出现扭体反应时间即扭体潜伏期（s）和15min内出现扭体反应的次数，15min内未出现扭体的，潜伏期记为900s，计算镇痛百分率=（模型组扭体次数-给药组扭体次数）×100%/模型组扭体次数。

1.6 大鼠福尔马林致痛实验 SD大鼠30只，雌雄各半，随机分为空白组、模型组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组6只，按1.3项下方法给药（空白组参照模型组给药方式），末次给药30min后，除空白组外，其余各组大鼠右侧后足皮下注射5%福尔马林100μL，以皮丘形成为注射成功，立即观察并记录各组大鼠第一时相（0～5min）和第二时相（15～60min）舔咬后足持续时间（s），作为疼痛评价指标。实验完成后，各组大鼠采用腹主动脉取血，于离心机分离血清，按照ELISA试剂盒说明书分别测定IL-6、TNF-α和PGE2浓度。

1.7统计分析 数据采用平均值加减标准差（x±s）表示，SPSS 26.0进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 行为学实验结果

2.1.1 小鼠热板舔足实验 各组小鼠基础痛阈值相比较无显著性差异（P>0.05），给药后30min和60min高劑量组与模型组痛阈值相比有显著性差异（P<0.05）;高剂量组给药后60min和90min的痛阈值与给药后30min相比均有显著性差异（P<0.05），各组给药后60min和90min的痛阈值相比无显著性差异（P>0.05）。见表1。

2.1.2 小鼠纳络酮拮抗-醋酸扭体实验 模型组、低剂量组及纳络酮+高剂量组与高剂量组潜伏期及扭体次数相比均有显著性差异（P<0.05）。见表2。

2.1.3 大鼠福尔马林致痛实验 各组大鼠舔咬后足持续时间第一时相相比无显著性差异（P>0.05），高、中剂量组与模型组舔咬后足持续时间第二时相相比有显著性差异（P<0.05）。见表3。

2.2 血清指标 空白组、高剂量组和中剂量组大鼠血清IL-6浓度均与模型组相比有显著性差异（P<0.05）;空白组血清TNF-α浓度与模型组相比有显著性差异（P<0.05）;空白组、高剂量组和中剂量组血清PGE2浓度与模型组相比有显著性差异（P<0.05）。见表4。

3 讨论

疼痛是炎症和癌症等病理状态下机体的主要反应[9]。本实验采用物理刺激和化学刺激两种致痛模型，以行为学和血清致痛因子浓度为指标研究弩药液的镇痛作用。

热板法是筛选镇痛药物的一个经典的热刺激致痛法[10]。实验结果显示弩药液能够显著降低小鼠热板致痛模型末次给药后30min和60min的痛阈值，高剂量组在末次给药后30min的痛阈值与末次给药后60min和90min均有显著性差异，说明弩药液对小鼠热板致痛模型具有显著镇痛作用，且在末次给药后30min的镇痛作用最为显著。

醋酸扭体法是筛选镇痛药物的一个常用化学刺激致痛法[10]。实验结果显示弩药液能够显著减少小鼠醋酸扭体致痛模型扭体潜伏期和15min内的扭体次数，说明弩药液对小鼠醋酸扭体致痛模型具有显著镇痛作用，实验进一步加入纳络酮拮抗组，结果显示纳络酮能显著拮抗弩药液的镇痛作用，纳络酮是阿片类受体拮抗剂，说明弩药液的镇痛作用可能作用于阿片类受体。

福尔马林致痛法是经典的炎症致痛模型，第二时相为体内炎症因子大量产生而导致疼痛的时期[10]。实验结果显示弩药液能够显著减轻大鼠福尔马林致痛模型第二时相舔咬后足反应的持续时间，说明弩药液对大鼠福尔马林致痛模型具有显著镇痛作用，且可能与下调炎症因子表达有关。

炎性疼痛是疼痛的主要类型[11]，IL-6、TNF-α和PGE2是与疼痛相关的炎症细胞因子，福尔马林致炎后大鼠体内炎症细胞因子浓度升高，促进疼痛产生[12]。实验结果显示，模型组大鼠血清IL-6、TNF-α和PGE2浓度均显著升高，说明造模成功，弩药液高剂量组和中剂量组血清中IL-6和PGE2浓度与模型组相比均显著性降低，TNF-α浓度与模型组相比呈降低趋势但差异不显著，即弩药液可显著降低血清中IL-6和PGE2浓度，降低TNF-α浓度，说明弩药液的对大鼠福尔马林致痛模型的镇痛作用可能与显著下调IL-6、PGE2浓度有关，而与TNF-α浓度相关性不大。

综上所述，弩药液可能是阿片类镇痛药，对多种疼痛模型具有显著镇痛作用，且对炎性疼痛模型的作用可能与下调炎性因子表达有关，但具体机制仍需实验验证。

参考文献

[1]

AMANDA，De C，張钰，等.疼痛新定义[J].中国疼痛医学杂志，2016，22（11）：808-809.

[2]李华，黄淑凤，邓翀，等.大血藤镇痛作用和抗炎作用研究[J].陕西中医，2013，34（10）：1427-1428.

[3]陆怡，朱元章，郭晨旭，等.飞龙掌血醇提物的抗炎镇痛作用[J].中成药，2018，40（1）：26-32.

[4]陈应康，佘福强，刘大腾，等.苗药透骨香抗急性痛风性关节炎作用的实验研究[J].中药材，2016，39（9）：2118-2121.

[5]李静，田芳，李美艳，等.白屈菜提取物中生物碱的镇痛抗炎作用研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（8）：262-265.

[6]黄明进. 黑骨藤抗炎和镇痛作用的实验研究[C].//邱德文.中药化学研究与药物创新——中华中医药学会中药化学分会2006年度学术研讨会论文集.2006：251-254.

[7]李祖成，王月，赵峰，等.鸭跖草镇痛活性部位筛选及作用机制研究[J].中成药，2020，42（11）：3021-3024.

[8]叶勇，章波，白玉燕，等.三叶青藤提取物经皮给药抗炎镇痛作用研究[J].时珍国医国药，2020，31（12）：2843-2846.

[9]COOK A D， CHRISTENSEN A D， TEWARI D，et al. Immune Cytokines and Their Receptors in Inflammatory Pain[J]. Trends in Immunology， 2018，39（3）：240-255.

[10]张玉玲，佟继铭.疼痛实验动物模型研究概况[J].承德医学院学报，2009，26（2）：195-198.

[11]PATAPOUTIAN A， TATE S， WOOLF C J. Transient receptor potential channels： targeting pain at the source[J]. Nat Rev Drug Discov， 2009，8（1）：55-68.

[12]聂晶，杨占双，杨松，等.新生儿缺氧缺血性脑病对c-Fos活性、疼痛反应以及血清神经可塑性调节因子的影响[J].临床和实验医学杂志，2019，18（15）：1628-1631.

（收稿日期：2021-11-02 编辑：陶希睿）