高能重离子束辐射水稻诱变育种研究进展

温晓婷,张鑫,李景鹏,余丽霞,周利斌,杨福

(1.中国科学院 东北地理与农业生态研究所，吉林 长春 130102；2.中国科学院大学，北京 100049；3.中国科学院 近代物理研究所，甘肃 兰州 730000)

0 引 言

人工诱变将植物的突变频率提高了约10～1 000倍[1]，广泛应用于各个领域，在提升作物产量[2]、改良瓜果蔬菜[3]、改造花卉[4]以及微生物育种[5]等方面取得了巨大成果。利用各种诱变技术已培育出3 000多个植物品种，其中培育的水稻品种约占25%[6]。重离子束是一种新型诱变剂，相比于诱变育种中其他诱变源，重离子具有较高的传能线密度(Linear Energy Transfer，简称LET)和较高的生物学效应(Relative Biological Effectiveness，简称RBE)，可以在较高的存活率下获得较高的突变率，引起更为显著的生物学效应[7]。重离子束的种类一般包括碳(C)、氮(N)、氖(Ne)、氩(Ar)、铁(Fe)、氦(He)和氧(O)。我国科学家余增亮等[8]利用离子束本身具有的质量沉积、能量沉积、电荷沉积、离子溅射、局部刻蚀和通道作用，率先将低能离子束注入技术用于水稻等农作物的品种改良，首创了具有自主知识产权的低能离子束注入和低能离子束介导转基因技术[9]。至此，离子束注入技术作为一种新方法，一个新兴的交叉学科—离子束生物工程学问世，并立即受到国内外专家的关注。日本在重离子束辐射水稻诱变技术研发及应用领域走在世界的前列，把重离子束辐射生物技术列为“人类前沿科学计划”，成为21世纪生命科学研究的支撑技术之一[10]。重离子束主要分为能量大于MeV的高能重离子束和能量在KeV范围内的低能重离子束[11]。我国最初关注低能重离子束辐射对植物的影响[8]，直到近几年才将高能重离子束辐射诱变技术应用到农作物育种方面，而日本这方面研究的较早，并在水稻方面开展了研究，培育出了水稻新品种。本文简述了近些年国内外高能重离子束辐射诱变技术在水稻育种方面的研究，重点介绍了高能重离子束辐射诱变水稻的原理及特点，辐射诱变引起的水稻各性状的改变及水稻新品种的培育，以期为高能离子束在水稻育种中进一步应用提供有价值的参考。

1 高能重离子束辐射诱变水稻的分子生物学特点

高能重离子束是由回旋加速器产生的加速离子沿着粒子路径在局部区域密集形成的高效能量沉积[12]，具有更高的传能线密度，对目标生物的DNA及蛋白质等分子有更大的损伤。研究表明LET值越高，会诱导越复杂的双链断裂(Double strand break,DSB)[13]。DSB的修复途径主要有两种：同源重组(Homologous recombination,HR)和非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)[14]，NHEJ为C离子辐射植物DNA损伤的主要修复途径[15]，可在各个细胞周期发生，该修复途径不依赖于同源基因，因此更容易导致复杂的基因突变[16]。

射线与高能重离子束的诱变原理相似，都是将快速运动的带电粒子作用于目标植物，但由于加速粒子沉积方式不同，产生了不同的诱变效果[17]。已有研究表明高能重离子束与射线的诱变效果存在显著差异(表1)。Li等[18]通过比较诱变水稻的全基因组测序结果发现，γ-射线倾向于诱导小的突变，而C离子束主要诱导结构变异(Structural variant,SVs)，后者的遗传变异类型是遗传多样性的来源[19]。Yang等[20]通过比较γ-射线与C离子束对水稻的诱变特性发现，γ-射线诱导更多的多核苷酸变异(Multiple nucleotide variant,MNV)，而离子束更多的诱导小的插入与缺失和大片段缺失，并没有发现SVs。产生以上结果差异的可能原因为：使用的材料不同[21]、辐射剂量不同[22]、测序方法和数据分析手段的不同[19]。因此，高能重离子束能产生更多的基因组变异类型，有更高的相对生物学效率、更宽的突变谱[23]以及更高的诱变效率[24]。

表1 高能重离子束辐射与其他物理辐射的对比

化学诱变中常用的诱变剂为烷化剂，可将碱基烷基化，发生嘌呤与嘧啶的转化以及置换突变[30]，主要引起单核苷酸变异(Single nucleotide variant,SNV)[31]，而高能重离子束可诱导产生更多的基因变异类型和更高的染色体畸变率[22]。Oono等[31]对水稻品种日本晴的突变体进行分析发现，高能重离子束主要诱导GC>AT的转换，占38%，其次为AT>GC，占33%，而甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate,EMS)优先烷基化鸟嘌呤(G)的残基，主要诱导GC>AT的转换，为93%[32]，且在Phe、Ile、Lys、Asn和Tyr的非同义位置缺少G和C，只产生26种氨基酸转换类型[33]，而离子束辐射不存在特异性，可诱导170种氨基酸转换类型[31]。Kazama等[14]比较了重离子束和EMS的诱变效应，发现重离子束主要诱导大片段的缺失与重排，EMS诱导更频繁的渗漏突变。相较于EMS，高能重离子束有更强的穿透力，可更快诱导突变发生，并且化学诱变剂多为有毒试剂，对人体造成极大危害[17]。

低能重离子束单核能仅KeV，对植物组织的穿透深度极浅[34]，可对靶向组织的细胞膜和细胞壁产生刻蚀作用，使后续离子束沿着刻蚀通道攻击遗传物质[35]，而高能重离子束的单核能在MeV以上，可穿透植物组织深度达几厘米[36]，直接作用于植物遗传物质，对植物基因的物理损伤更大，产生更丰富的基因组变异类型[37]。

因此，高能离子束较射线辐射、化学诱变剂及低能重离子束的辐射效果更好，可以产生各种类型的遗传变异，以及更广泛的突变表型。可见，高能重离子束在水稻育种中有很大的应用潜力。

2 用于诱变水稻的高能重离子束种类、辐射剂量及受体材料的选择

2.1 高能重离子束的选择

离子束的种类很多，选择合适的离子束对于水稻育种是非常重要的。已有研究证实不同种类的重离子束产生的诱变效果不同。Kazama等[14]对不同诱变处理的拟南芥进行高通量测序，发现Ar离子束主要诱导染色体重排，C离子束主要诱导单碱基替换(Single base substitutions,SBS)和小片段的插入与缺失，产生差异的原因可能为Ar离子束与C离子束诱导的基因的修复途径不同。Sjahril等[38]发现C离子束辐射产生更多的突变植株类型，而Ar离子束辐射的突变体后代发芽率更高。并且有研究表明C离子束辐射的相对幼苗存活率高于Ar和Fe[39]。不同的离子特性决定了LET的值，LET越高产生的DNA损伤越多，在需要高LET时，应选择较重、带高电荷且速度较慢的离子[11]。

2.2 最佳辐射剂量的选择

高能重离子束的不同辐射剂量有不同的诱变效果，有研究发现高剂量辐射抑制生长，而低剂量辐射可促进生长[40]。Zhao等[41]利用不同剂量的碳(C)离子束辐射水稻，发现低剂量的重离子束主要诱导CG位点的高甲基化，可能激活生物的代谢、合成机制；高剂量的重离子束诱导CG位点的低甲基化，可能诱导植物的抗逆性。因此需选用最佳辐射剂量以获得最大效果的突变。Yamaguchi等[29]发现水稻种子的存活率与辐射剂量存在“肩部”效应曲线，通过比较辐射水稻的突变率与致死率，发现肩部剂量是不改变遗传背景而获得有用突变体的标准；并表明220 MeV和320 MeV的C离子束以及100 MeV的He离子束诱变水稻的肩部剂量分别为20 Gy、60-80 Gy以及150 Gy[17]。而一些学者认为存活下来的植株有更大的变异幅度，将半致死率作为最佳辐射剂量[42]。最佳辐射剂量的选择需依据突变体的萌发、早期生长以及田间出苗等性状指标以及染色体变异和染色体分裂等细胞学形态来衡量[43]。

2.3 辐射受体材料的选择

不同发育阶段的组织对离子束的敏感性不同，一般选用的靶向材料为花药、愈伤组织，发育中的胚和茎节、吸涨后的种子、幼芽以及干燥的种子[44]。水稻中最常用的诱变组织是种子，种子含水量直接影响其辐射敏感性，吸水种子的敏感性高于干燥种子，在125 MeV·u-1的C离子束辐射下，干种子的最佳辐射剂量是150 Gy，而吸水种子的最佳辐射剂量为20 Gy[45]。含12%～15%水分的种子有更好的诱变效果，可避免氧的增效作用，复合辐射产生的自由基，降低对种子的损伤，提高种子存活率[46]。

3 高能重离子束辐射诱变水稻重要性状基因功能分析

利用高能重离子束已经产生了许多具有不同优良性状的突变体，不仅丰富了种质资源库，还为进一步探究了水稻的分子与生理机制提供基础。

3.1 水稻重要农艺性状基因功能研究

水稻农艺性状的改良是提高作物产量的重要手段，许多研究挖掘了产量与性状之间的关系，在水稻中产量由株高、生育期、分蘖能力、穗长、粒型、结实率和每穗粒数等间接性状以及每株穗数，每穗饱满粒数和千粒重等直接性状决定[47]。利用高能重离子束可对水稻的多种农艺性状产生影响(表2)。

表2 高能重离子束诱变水稻产生的表型改变

水稻的矮化增加了水稻的抗倒伏性，也更多的将光合作用产物转移到生殖生长中，提高水稻产量[48]。庄楚雄等[49]利用Ar离子束辐射水稻，产生了由隐性基因控制的半矮杆突变表型，初步定位发现突变位点与Semi-dwarfgene(Sd-1)不连锁，对两个突变株系Ar-10和104进行限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP)比对，推测突变位点位于突变热点附近。Oono等[31]筛选出了由碳(C)离子束诱变产生的矮化突变体3098和885，利用全外显子测序分析发现，3098突变体在Guaninenucleotide-bindingProteinAlpha-1subunit(GPA1)上存在128 kp的缺失，表现为Daikoku矮化(D1)特征，并推测该突变为杂合突变，在突变体885中并没有检测到相关基因的突变。

水稻抽穗期是水稻重要的农艺性状之一，决定了品种种植地区及季节适应性[50]。Ichitani等[51]利用220 MeV的C离子束诱变粳稻品种Taichung 65产生了晚抽穗突变体KGM26、KGM27，分别由纯合隐性基因FLOWERINGTIME1(FLT1)和FLOWERINGTIME1(FLT2)控制。连锁分析发现FLT1位于8号染色体的短臂上，推测与Earlyheadingdate3(Ehd3)在同一位点上；FLT2位于9号染色体着丝粒附近，是一个新的基因。Oono等[31]利用高能C离子束产生了早抽穗突变体786-5、IRB3517-3和IRB3790-2，早抽穗突变体786-5在M3代中纯合，测序分析发现突变体的PHYTOCHROMEB基因上存在一个5bp的缺失；在IRB3517-3中与早抽穗相关的基因定位在3号染色体上，存在33.6 kb的缺失，并推测HEADINGDATE16(HD16)是假定的候选突变基因；IRB3790-2在M5代获得纯合突变株系，并在6号染色体上检测到染色体倒位(Inversions,INV)，一个INV突变位点位于HEADINGDATE1(HD1)基因的第二外显子上，该基因编码锌指转录因子，调节HEADINGDATE3(HD3)基因的表达。

叶片是水稻光合作用的主要场所，叶片损伤也会对水稻产量造成严重损失[52]。Peng等[53]利用C离子束辐射产生了叶片异常萎蔫的突变表型，通过混合群体分离分析(Bulked segregant analysis,BSA)、分子标记连锁分析和MutMap分析将突变位点位于11号染色体上的着丝粒区域，约1 030 kb之间，同一位点上的6个基因发生了非同义突变，结合基因表达水平推测LOC_Os11g19810为m3基因，编码含有PWWP结构域的蛋白。Yamatani等[54]在C离子束辐射后代中筛选出E型持绿突变体delayedyellowing1-1(dye1-1)，精细定位表明DYE1编码PSI天线复合体的亚单位—Lhca4，其第二外显子上存在单碱基替换，使蛋白稳定性降低。蛋白质电泳分析显示突变体的PSI-LHCI超复合体中存在严重缺陷，但LHCII的含量显著上升，为研究LHCI与LHCII之间的相互作用提供了材料。Maekawa等[55]利用高能C离子束在稳定的黄叶突变体中诱导产生了杂色黄叶突变体，且该突变体可与分离的恢复体共遗传，通过分析推测稳定的黄叶表型是由非自主性转座子引起的，由离子束辐射产生的染色体断裂而导致的低甲基化激活了沉默的自主转座子。

通过离子束诱变产生了不同农艺性状的突变，利用正向遗传学手段将突变表型与基因建立联系，对挖掘水稻基因以及阐明诱变本质具有重要的作用。

3.2 水稻主要品质性状的基因功能研究

随着人们生活水平的提高，对食物的需求不仅仅局限于饱腹这一方面，粒型、淀粉含量、安全性作为衡量水稻品质性状的重要指标，挖掘更多调控基因，解析其调控机制也成为近年来的热点方向。利用高能重离子束诱变也可以对水稻的品质性状进行改良，从而满足人们对高品质水稻的追求。

不同地区对水稻粒型与口感的需求不同[56]。Morita等[57]利用高能离子辐射粳稻品种日本晴，产生了只有籽粒长度增加的longgrain1(lin1)突变体，对F2代进行表型关联分析发现，在Os06g0675200基因(LIN1)上存在1bp的缺失，产生了长粒突变体表型，并发现LIN1基因在种子植物中广泛同源，有望通过基因渗入或CRISPR编辑技术改变粒型。程维民等[65]利用高能C离子束辐射武运粳7号，产生了直链淀粉及蛋白含量变异的突变体，其变异系数分别为13.7%和12.8%，并将品质性状与农艺性状进行了相关性分析，发现直链淀粉含量以及蛋白质含量与水稻表型密切相关，对品种的选育有指导意义。

水稻中有毒物质的积累不仅阻碍水稻的正常生长，也危害人体健康。Ishikawa等[66]利用高能C离子束辐射日本水稻品种越光，得到了镉(Cd)含量极低的突变体(lcd-kmt1，lcd-kmt2，lcd-kmt3)，对杂交突变体后代进行连锁分析和候选基因的图位克隆发现，突变基因位于7号染色体上，编码假定的重金属转运蛋白OsNRAMP5，控制Cd离子的转运，并开发了检测OsNRAMP5多态性的DNA标记，有望通过标记辅助选择将该基因转移到其它水稻品种中。Ishikawa等[67]利用高能C离子束辐射越光，得到了铯(Cs)含量是野生型一半的突变体(lcs1)，对杂交品种进行数量性状位点(Quantitative Trait Locus,QTL)分析，与放射性元素降低相关的主效QTL定位于6号染色体上，经过序列比对发现是编码SALT OVERLY SENSITIVE 2(OsSOS2)蛋白的基因发生了缺失，并且发现同时携带lcs1与lcd-kmt2等位基因的水稻株系，有望培育具有低镉且低铯(Cs)含量的水稻新品种。

利用高能重离子束辐射水稻能产生较宽的突变谱[17]，可诱导产生不同品质性状的突变，有利于快速筛选出有利突变进而出培育优质水稻品种，且相较于转基因技术，辐射诱变所产生的水稻新品种更容易被人们接受。

3.3 水稻抗逆性的基因功能研究

在自然条件下，水稻会遭受包括病虫害、土壤盐碱、干旱及高温低温等一系列的生物胁迫和非生物胁迫，提高水稻对不利环境的适应性是改良水稻的一项重要研究。

开发抗病水稻品种、研究抗病分子机制对提高水稻产量有非常重要的价值，利用高能重离子束辐射诱变技术培育出许多抗病水稻新品种[2,45,62]，但没有进一步的探索。而对低能重离子束诱变产生的抗稻瘟病突变体目前已经进行了较深入的研究。DNA指纹图谱分析突变体存在多态性片段，测序分析发现该片段与假病斑基因(Spl11)相关[68]。Xu等[69]利用低能N离子束(25 KeV)与中能Ne离子束(80 MeV)诱变得到的spl29、spl30、spl31和spl33突变体，这些突变体由单隐形基因控制，通过基因定位发现spl29和spl31为spl1的等位基因，而spl30与spl33可能为新的抗病基因，该研究为创建突变体文库提供了宝贵的材料。

盐碱和干旱是限制水稻生产的重要因素，培育耐盐、耐旱水稻品种可减轻土地资源浪费及种植区缺水造成的负面影响。Hasan等[62]利用C离子束辐射MR219，筛选出22株耐盐和35株耐旱突变体，在M3代中发现了纯合突变系，为研究水稻耐盐、耐旱的生理机制提供了优良种质资源。Zhang等[70]利用C离子束辐射通禾899，产生了耐盐碱突变品系东稻122。Ichida等[71]利用C离子束辐射日本晴，筛选出了耐盐的水稻品系6-99，14-45和18-36。对此类突变系的调控基因及机制分析并没有进行深入研究，可能原因是植物的耐旱、耐盐性是由多基因控制的，且受外界环境影响很大[72]。利用离子束诱变产生的此类水稻新品种，对于盐碱地的开发具有非常重要的作用。

温度过高或过低都会对水稻产量造成负面影响，温度过高会增加水稻垩白率，影响水稻外观，进而影响水稻的品质性状。Tabassum等[73]从高能C离子束辐射后代中分离出在高温下水稻垩白率极高的温敏粉状胚乳(flo11-2)突变体，进行全外显子测序及基因检测分析发现，编码cpHSP70-2的基因存在A>T的替换，并通过回补实验得到了验证。flo11-2突变体是作为研究高温对水稻影响的有用模型。水稻是冷敏感作物，温度过低阻碍水稻生长甚至导致死亡[74]。Morita等[75]在C离子束诱变的水稻突变后代群体中发现了对低温敏感的突变体csv1，在低温下表现褪绿表型，进行图位克隆发现CSV1基因定位于5号染色体上，编码假定的FAD/NAD(P)氧化还原蛋白，并且在多种植物中发现了CSV1同源基因，进一步的补充了水稻的耐冷机制。

分析水稻突变体对于挖掘水稻基因功能具有重要的作用，高能重离子束诱变创制了新基因，可通过基因编辑技术应用新基因，创制新的突变品种。

3.4 对其它性状基因功能分析

远缘杂交不亲和严重阻碍了优良种质资源的开发，打破远缘杂交不亲和性对于优良水稻品种的研发具有非常重要的意义。Koide等[76]通过对亚洲栽培稻(Acc108)和非洲栽培稻(Acc108S1)杂交得到的种子进行离子束诱变，得到Acc108S1M突变体，该突变体有极高的花粉育性，通过分析突变区域以及序列比对，发现突变体在S1基因座中存在5 bp的缺失，命名为SSPmut，并没有在Acc108中发现同源基因，且该基因邻近OgTPR1基因，两基因在配子发育中共表达，通过转基因以及杂交分析表明SSP-gla与其他因子在S1基因座上诱导不育。因此，可以通过高能重离子辐射诱变技术创建中性等位基因来克服远缘杂交不育性。

4 高能重离子束辐射在水稻新品种培育上的应用

4.1 水稻辐射亲本材料的选择

一般选择辐射敏感性强，综合性状良好，杂合基因型优良的水稻作为亲本材料。有研究表明不同水稻品种的辐射敏感性不同，辐射敏感的植株有更高的突变频率[77]，粳稻的敏感性大于籼稻，但气候型品种间的差异不明显[78]；综合性状优良，缺陷性状极少的品种更容易进行筛选，更易获得成功[79]；辐射具有优良杂合基因型的亲本材料可以增加染色体的交换率，产生超亲世代，提高植株的变异频率，扩大突变范围[80]。

4.2 辐射后代突变体的筛选

针对不同的突变类型需选用合适的筛选手段。水稻品种的选育分为直接选育和间接选育。直接选育即对水稻的突变性状直接进行观察统计，适用于对水稻株高、分蘖、熟期、粒型等可见性状的筛选，直接选育是诱变育种中最基本也是最常用的突变筛选手段。间接选育即需借助一些手段来识别突变体。如利用基于同步辐射的傅里叶转换红外吸收光谱(Synchrotron radiation-based Fourier transform infrared,SR-FTIR)[81]来检测抛光大米中的碳水化合物及蛋白质的含量，利用凯氏定氮法[65]来检测水稻中的蛋白质含量以及利用毛细管耦合质谱仪(GE-MS)筛选低草酸盐含量的水稻突变体[82]；有些需要将突变体置于一定环境中才表现突变性状，如对抗病，低温及耐盐碱等突变体的筛选；对突变体的分子筛选可以阐明突变的本质，解决基因表达不充分问题，如定向诱导基因组局部突变技术(Targeted Induced Local Lesions in Genomes,TILLING)可直接在基因水平上对重离子束诱变后代进行筛选[17,83]，还可通过微阵列技术来监测离子束诱变水稻突变体中miRNA的表达[84]，此外，结合分子标记辅助选择技术将会极大的提高了水稻选育的效率[66]。对水稻突变性状的选择要避免“木桶效应”，应选取综合性状优良的水稻突变体。

4.3 辐射诱变培育的水稻品种

由高能重离子束诱变技术结合不同的选育手段已经培育许多水稻新品种。孟加拉国原子农业研究所利用高能C离子束辐射技术培育出矮杆、生育期短、产量高且耐旱的品种Binadhan-14和Binadhan-19，适宜种植于孟加拉国干旱多发的地区[85]。Ishikawa等[67]利用高能C离子束辐射日本水稻品种越光，筛选及培育得到了Cd含量极低的品种Koshihikari Kan No.1，并已经在日本有了广泛的种植。湖南省农业科学院利用高能重离子束诱变产生了低镉含量的莲两优1号，莲两优100以及稻韶香100的杂交稻组合品种[86]。马来西亚普特拉大学利用高能重离子束对MR219的辐射产生了有益于糖尿病患者食用的水稻ML3与ML30品种[87]。近些年，研究者所在课题组一直致力于由高能C离子束诱变产生水稻新突变体的研究，得到了耐盐碱品种东稻122、东稻211、东稻812和优质米种东稻862，都已通过国家审定，并已累积推广35 000 hm2。

5 存在的问题及展望

高能重离子束诱变产生新的水稻突变品种，创制了新的种质资源，丰富了水稻突变体库，对于水稻的基础研究以及品种改良具有非常重要的作用，但仍有亟待解决的问题：

5.1 高能重离子束的定点突变

高能重离子束存在杀伤力广、破坏性大的物理特性，产生了复杂的基因组变异类型，相较于精准突变，诱变产生的突变表型更加随机，难以得到只包含目标性状的突变，因此开发应用于水稻育种中的离子束定向诱变技术，对获得理想突变体有非常重要的意义。

5.2 辐射诱变机理的研究

利用高能重离子束已经产生了各种类型的水稻突变体，但对很多突变体的研究仅仅局限于表型和现象的描述，并没有进行更加深入的探讨。对水稻突变本质进行深入研究，不仅可以将其应用于水稻育种中，还可以揭示双子叶植物的分子调控机制。随着测序技术的发展以及分析仪器的改进，对于水稻分子生物学及生理生化的研究提供了基础平台。

5.3 精准测序结果

为了探寻突变本质，对突变位点进行了筛选，但由于测序深度、测序手段与数据分析工具的不同，使得到突变结果有很大的差别。测序偏差的存在，影响了数据挖掘的准确性，因此就需要研究出新的方法来改变这一缺陷，且不同实验室的实验设计和数据挖掘流程存在差异，因此很难比较实验结果。但是随着测序技术以及分析技术的不断发展，一旦突破了这些瓶颈，对于水稻突变体的研究将会有巨大突破。

现在已经进入到育种的黄金阶段，中央一号文件的正式公布，为育种工作提供了政策支持[88]。高能重离子束在水稻育种中的广泛应用，产生了大量具有优良性状的突变体，扩充了水稻突变体库，并有利于未来超级稻的开发。近年来对水稻突变体的研究开始聚焦到分子水平，对控制表型的基因进行了精细定位，开发遗传标记，并应用于水稻育种中。诱变育种与分子育种的结合大大缩短育种年限，提高了育种的定向性和效率，且随着测序技术及分子育种技术的不断发展，两种育种技术的结合将会出现“1+1>2”的效果。