柴利军：十五载等待柑橘飘香

干思思

柑橘，是目前世界第一大类水果，也是我国种植面积最广、产量最高的果树之一。自古以来，围绕柑橘流传的各类诗文篇章不绝于耳。如今，市面上所见的各式各样的橘、橙、柚还有柠檬等都属于柑橘一族。为何柑橘家族能发展得如此庞大？种类如此繁多？

“关键还是它们特别能杂交。”华中农业大学教授柴利军介绍，通过研究发现，柑橘家族其实都来自于3个基本种——橘、柚、枸橼，其他栽培种类都是它们相互杂交产生的后代。不过，这些后代们在外观、口感、性状等方面均表现出巨大的差异。比如琯溪蜜柚一颗籽也没有，而沙田柚却有很多;大部分柑橘不授粉也能正常结果，有些柚子却只能人工授粉才能结果……背后的原因到底是什么？为了探清柑橘进化机制背后的秘密，柴利军一做就是15年。

谁在控制柑橘“传宗接代”

自然界中，绝大部分被子植物都是两性花，即一朵花上既有雌蕊又有雄蕊，并且发育都正常。理论上，这样的植物可以实现自交授粉产生后代，比如柑橘家族中宽皮柑橘就可以实现，但实际上这样的植物属于极少数。大部分两性花植物自交授粉后，花粉管在柱头或花柱中上部就会被抑制生长，无法正常产生后代，这种现象被称为“自交不亲和”。

“从植物进化角度来看，这种现象是有道理的，就跟人类禁止近亲繁殖一样，如果一个物种可以自交授粉，无疑加大了后代各类隐性遗传病的概率，随着环境变化逐步失去竞争力，最终被淘汰。”柴利军介绍，“植物也是很聪明的，为了保护后代在长期进化过程中不被淘汰就形成了这种机制，抑制自交授粉。”

柑橘中柚类多数表现为自交不亲和，以沙田柚为例，就具有典型的自交不亲和特性，自交坐果率仅0.3%，这就导致果农在生产中需要配置酸柚做授粉树或者每年春季都要爬到树上给柚子人工授粉，费时费力，还十分危险。“所以我们想搞清楚这个机制到底是什么东西在控制，为什么不能用自己的花粉授粉。”

前期，科学家们其实已经突破了十字花科、茄科、蔷薇科、车前科及罂粟科等物种自交不亲和机制的奥妙，但在芸香科柑橘属植物领域仍是一片空白，究其原因还是柑橘漫长的生长周期导致。

俗话说，“桃三李四柑八年”。柑橘从种子种下到结出果实需要八九年的时间，极大限制了科学家的观察研究，国内外专注于这一领域的学者极少，柴利军正是国内较早研究柑橘自交不亲和特性的学者之一。

2005年，刚从华中农业大学本科毕业，考入本校园艺林学学院邓秀新院士门下的柴利军，第一次接触到了柑橘自交不亲和机制研究的课题。在他之前，课题组从来没有人从事过相关研究，国内外关于这一领域的研究报道也屈指可数，可借鉴的东西不多。为此，最初他只能借鉴其他物种的经验，通过反向遗传学的方法，利用报道中提到的其他物种某个可以控制性状的基因，以此来反向研究柑橘。在硕博连读7年毕业后，柴利军入职华中农业大学园艺林学学院果树系，继续相关事业，2014年，他申请的研究项目获得了国家自然科学基金的资助，不过最终的结果却不尽如人意。

“现在想起来确实非常感谢国家自然科学基金一直以来的支持，能够允许试错、允许失败。那个项目其实就是一个探索型项目，虽然失败了，却让我们意识到反向遗传学的方法是行不通的，我们必须改变方向。”柴利军介绍道。

适逢2013年，导师邓秀新院士团队徐强教授首次绘制出了甜橙全基因组序列图谱，开启了柑橘的基因组时代，为国内外同行研究芸香科柑橘的特殊生物学性状、功能基因组提供重要平台。基于此，柴利军彻底更换思路，从反向遗传学改为了正向遗传学，直接进行柑橘的遗传群体研究。

这次，在庞大的柑橘家族中遴选研究对象时，柴利军及其团队将目标放在了典型的自交不亲和物种——沙田柚上，其单胚的特点可以排除多胚对自交和杂交的干扰。经过长达八九年的研究，研究团队终于锁定了一个关键基因，也就是控制柑橘自交不亲和的决定因子——S-RNase蛋白。

“这个蛋白很特别，编码该蛋白的基因具有花柱特异性表达、单一位点复等位基因和能够特异性抑制自体花粉管生长这3个典型特征。”柴利军介绍，這一特殊的基因是导致大部分柑橘自交不亲和的原因。解决了柑橘主要的自交不亲和性状之后，另一个特殊的现象也进入了他们的研究视野。与大部分柚类具有自交不亲和性状不同，宽皮柑橘及其杂交种普遍存在自交亲和的特性，这又是为何？

“其实就是基因突变导致的。”在检测自交亲和宽皮柑橘材料时，柴利军团队发现了其S-RNase基因ORF第442位有一个腺嘌呤（A）缺失，从而导致移码突变和提前终止，形成了无功能的Sm-RNase蛋白。最后，通过扩大样本检测量，他们明确了凡是含有突变的Sm-RNase都具有自交亲和性状。

找到了控制柑橘生殖方式的密码之后，柴利军带领团队进一步开发出了基于Sm-RNase的分子标记，建立了一个柑橘属Sm-RNase基因型信息库，为早期开展分子标记辅助选择自交亲和的柑橘资源提供了方法。并且，在丰富的柑橘种质资源优势之上，他们还进一步利用原始、野生及栽培柑橘资源，构建出柑橘由自交不亲和性向自交亲和性转变的演化模式图，推测出突变的Sm-RNase基因早期发生在宽皮柑橘中，伴随着柑橘种间相互杂交，进而渗入到其他柑橘品种中，并利用宽皮柑橘独特的无融合生殖特性逐渐将Sm-RNase基因在这些柑橘杂交种中固定，最终形成现有栽培柑橘多数表现为自交亲和特性的局面。

“掌握了这把生殖基因密钥，相当于拥有‘上帝之眼。柑橘正常结果要8年时间，但我们在苗期就能鉴定出是否属于自交亲和，它能跟哪些亲本配种。”柴利军介绍，这对柑橘产业发展而言意义重大。

甘坐科研“冷板凳”

2020年2月13日，柴利军团队这项历时15年的研究成果在国际权威期刊《自然·植物》（Nature Plants）在线发表。不仅如此，在发表的同时，《自然·植物》杂志特邀东京大学藤井聪太（Sota Fujii）和高山诚二（Seiji Takayama）两位专家对相关内容配发了评论性文章。评论指出，这项研究在植物交配系统进化起源研究史中具有里程碑式的意义。

柑橘历史悠久，我国是柑橘起源中心之一，也是野生及栽培柑橘最丰富的国家。柴利军团队的研究不仅在基础科研层面，首次揭秘了柑橘进化及繁殖机制，填补了芸香科柑橘属植物自交不亲和机制的空白历史，同时在产业层面，也为生产和育种选配合适授粉亲本及通过遗传改良培育自交亲和新种质提供了重要的理论依据。

柴利军介绍，实际生产过程中，一方面非常需要自交亲和性状品种，可以有效降低人工授粉及栽培授粉树产生的人工、时间、费用等成本;另一方面，现在的消费者大多不喜欢有籽水果，而自交亲和品种结果后会产生种子。而柑橘家族中，琯溪蜜柚除了具有自交不亲和性状外就兼具单性结实的本领，在没有授粉的情况下可以生成无籽果实，漳河蜜柚、晚白柚和水晶柚同样具有此优点。

“如果能将自交不亲和与单性结实两个性状相结合，就是最理想的状态。”柴利军说道，这样一来可以同时满足生产的实际需求及果实的品质，真正实现不需要人工授粉就可以产生无籽的果实，有助于促进柑橘产业的发展。在研究过程中，他们以柚类为主要研究对象，鉴定到9个高度多态性的S-RNase等位基因，并检测收集的394份柚类自然群体，获得其中77%的S基因型。

“拥有了这些相当于建立了S基因型的信息库。”柴利军介绍。在此之前，人们为柑橘家族授粉杂交时基本依靠感觉，盲目进行配对，如果碰到两个相同S基因型的品种，即使配对也无法产生杂种子代，但现在不一样了。“因为有了S基因型信息库，我们就成了科学‘红娘，到底合不合适，能不能做杂交，我们都一清二楚。”柴利军说道。

作为当今世界也是我国第一大水果产业，柑橘产业在国民经济中具有举足轻重的地位。研要为产业服务，自踏入柑橘研究的第一天起，柴利军就始终坚守着这一信念。

2021年8月18日，国家自然科学基金委公布了2021年集中接收期项目评审结果，柴利军的名字赫然在列，他成为年度国家自然科学基金优秀青年基金项目获得者。在相关项目支撑下，他将带领团队继续进行柑橘自交不亲和反应互作网络构建，揭示柑橘自交不亲和分子基础，助力柑橘育种和生产效率提升。值得一提的是，评审结束之后柴利军才听说，他的汇报给评委老师们留下了深刻的印象——十余年研究生涯只做一件事，现在像他这样甘坐科研“冷板凳”的人太少了。

“提到这里，我真的非常感谢我的导师邓秀新院士，一直全力支持我们这项研究。花了那么多人力、物力、财力，其间的十几年时间里都没有好的结果，换在其他单位、其他团队，可能早就坚持不下去或者面临考核淘汰了。”柴利军感叹，“只有邓老师一直坚定地支持我们，他说这个领域全世界都没有人做，只要我们沉下心来一头扎进去，一旦突破了就是这个领域的第一人。正是因为他一直以来的支持给了我莫大的鼓励，让我下定决心无论如何艰难也要做下去。”

柑橘研究的确很难，动辄十几年的苦心钻研，还没有任何结果，一般人可能根本不敢想象，就连柴利军自己也没想到过他能把这块“硬骨头”啃下来，并且还能在《自然》（Nature）子刊上发表成果，这是对他和团队多年坚持最好的回报。“科研很多时候就是不可预期的，只是不能所有人都追求短平快，总得有人来啃‘硬骨头。我只是觉得一步一步稳扎稳打，最终的结果应该是好的吧，就看我们如何去对待。”柴利军说道。

认定一个目标就奋力前行，也许正是骨子里带出来的这份“轴”才成就了柴利军与柑橘的不解之缘。

出生于陕西最北端——榆林府谷县一个小山村——柴家墕村的柴利军，童年记忆中总是充满了黄土高原的风沙。土地贫瘠、沟壑纵横，这样的地方离城市与梦想太过遥远。大字不识的父母没有教过柴利军任何人生秘诀，只告诉他一句话——要想跳出农门，必须去读书。他将这句话深深印在了心里，哪怕小学开始就得住校，每周独自走几十里路回一趟家也从没有想过放弃。因为心中承载着读书、考大学的目标，所有的艰难困苦对于柴利军而言都可以忍受。2001年高考，十几年的求学等待终于迎来花开，他顺利被华中农业大学园艺系录取。

从没有走出过陕西的柴利军，此前从未听说过华中农业大学的名字，他的第一志愿其实是西安交通大学，但并没有关系，只要有大学上就行了。柴利军非常珍惜这份来之不易的求学机会，进了大学后仍然一刻不敢放松，每天刻苦学习、钻研。大二就跟着老师做本科毕业论文，并下定了决心一定要考研。

“当时我们学校最出名的教授就是邓秀新教授，那时他刚被评为‘长江学者，我就想一定要考上邓老师的研究生。”柴利军回忆道。有的人凭借天赋出人头地，有的人则凭借一腔孤勇披荆斩棘。2005年研究生初试过后，柴利军的分数并不靠前，但在复试过程中，也许是被他坚定的目标及吃苦耐劳的品质所打动，邓秀新直接将他录取。

之后，也许是冥冥中自有天意，柴利军又被分到了没有任何人尝试过的柑橘自交不亲和研究领域。小时候，父母的一句话让他苦读十几年考上了大学;后来，考研的决心又让他成功进入了邓秀新教授的团队;现在，柑橘则成了柴利军终生奋斗的科研目标，哪怕“冷板凳”一坐就是15年，亦无怨無悔。

让科研精神代代相传

一篇论文，一个突破性成果的背后，到底包含了哪些因素？于柴利军而言，个人的坚持的确难能可贵，但更重要的还有团队的力量，是几代人的科研精神激励着他走到了今天。

最初接触柑橘自交不亲和机制研究时，柴利军只是一个刚考上硕士的研究生，国内外查不到相关文献，导师也没有这一领域的积累，但却给了他极大的自由和包容，鼓励他去国际上寻找当今世界研究自交不亲和领域的专家，谁做得最好就去联系谁，由课题组出资送他出国学习。

“后来我找到了英国皇家科学院院士英国伯明翰大学维罗妮卡·艾尔莎·富兰克林-汤（Vernonica Elsa Franklin-Tong）教授，她在罂粟科虞美人自交不亲和领域研究多年，是这个领域的顶级专家。当时初生牛犊不怕虎，就直接给她写了封信，想过去学习，没想到就被接收了。”柴利军回忆，“邓老师听说后非常高兴，课题组全力支持，资助我出国学习一年，真的非常难得。”

柴利军也没有辜负这份来之不易的学习机会，从没出国远行的年轻人，拎着一个行李箱就跑去了英国。而且落地时间正好赶上学校休息日，没有任何人对接，他就一个人完成了飞机、大巴、计程车几次辗转，再按照邮件留下的一封信找到了宿舍，利用邮件提供的密码打开门，安顿下来。两天后的工作日，当他出现在富兰克林·汤教授面前时，教授也被吓了一跳，完全没想到他这么快就自己过来了。

之后的一年，富兰克林-汤教授更是被这个中国来的年轻人深深打动了。每天早出晚归、三点一线，帮助她完成了两个大项目，由此她对中国人充满了好感。“外国导师每一次对其他学生说的都是‘你们一定要努力、要投入，唯独对我，每次说得最多的一句话就是要好好休息。”柴利军介绍，富兰克林-汤教授一辈子都在跟虞美人自交不亲和打交道，从她那里柴利军学到非常多宝贵的经验，并借鉴虞美人自交不亲和研究方法，回国后在柑橘自交不亲和研究过程中，基于多年生木本植物难以开展候选基因活体功能验证，建立了花粉离体培养不亲和体系，有效弥补了柑橘8年才能开花结果进行活体验证的困难。

时间，是柑橘领域自古以来最难攻克的命题。

从2005年到2020年，在研究柑橘自交不亲和的15年间，柴利军也从学生的身份转变成为导师。毕业那年，仍然是邓秀新教授全力支持留下了他。“邓老师说虽然这项工作做了7年还没有结果，但还是值得坚持并且必须要做的一件事。”不仅如此，为了支持他的工作，邓秀新教授还将当年从南京农业大学保送他门下第一名的学生梁梅，交给了柴利军来带。

接下来又是两年多不知未来前景的日夜钻研，仍然没有取得结果，硕士毕业面临转博的梁梅开始打起了退堂鼓。同学中或多或少都已取得成绩，只有她还在原地，更不知道未来方向……如同当年的邓秀新教授一样，这一次，柴利军接过了充当“定心丸”的重担，坚定地为学生指引方向，“项目已到了最后关头，马上就要到了拨开云雾见月明的时候了”。

重新树立目标的梁梅让柴利军深受震动。“她的拼劲是我见过的第一人，现在已经成为我们实验室的标杆了，同时也是我们《自然·植物》（Nature Plants）论文的第一作者。”柴利军说，那篇论文成果中还涉及了生物信息学，但整个课题组都没有相关经验，后来他为梁梅联系到了中国科学家昆明植物所一个研究信息学的同学。没想到电话沟通完不到一周，梁梅就自己一个人跑到那边安顿好向他报告了，之后更是用了不到3个月时间，就彻底将信息学的难点攻克。

“梁梅博士毕业后去了美国一个实验室从事博士后研究，当时还有一点遗憾。但后来在一次讲座中碰到她的外国导师，他对梁梅赞不绝口，说我给她培养了一名好学生，我就觉得很值得。”柴利军说，“每代人都有每代人的使命，科研工作是系统工程，在每一个阶段都需要有人去传承，因此培养人才也是我们的重要任务。我希望从我们实验室、我们学校走出去的每一個人都能成为顶梁柱，撑起新时代的脊梁。”

如今，柴利军所在的实验室又出现了一批新的人才，由在读博士生胡健兵为骨干的团队成员取得了柑橘自交不亲和调控机制的新进展，不久前发布在国际期刊《园艺研究》（Horticulture Research）杂志上。

找到柑橘自交不亲和关键因子只是第一步，后面还需要继续研究背后的调控机制及针对性开展的产业手段。“我们相信未来还会有更多、更好的成果，有人坚持下去就有希望。”柴利军说。

（责编：苏寒山）