微藻-真菌共生体净化沼液效果研究

詹新同

(钦覃(上海)环境工程有限公司，上海 200030)

沼液是沼气制备过程中常见的副产物之一，是一种具有高污染物负荷的污水，如不经处理而直接排放会对周边环境产生严重的危害[1-2]，因此沼液污染是限制沼气事业可持续发展的一个重要因素。近年来，微藻应用于污水处理的研究得到了越来越多的关注。Golueke等[3]在1957年就首次提出了将沼液应用于培养微藻的相关研究。Collet等[4]认为沼液包含了微藻生长所须的营养元素，且碳氮比(C/N)和碳磷比(C/P)都较低，非常适合微藻的大规模增殖。随后相关学者开展了利用微藻处理沼液的研究工作，如刘振强等开展了利用微绿球藻、小球藻和纤维藻在四种不同反应器(槽式反应器、直管式反应器、鼓泡式反应器和气升式反应器)中净化沼液的研究工作[5]；刘伟等[6]开展了利用猪场沼液养殖微藻连续系统的设计和应用研究。以上研究均表明微藻对沼液的生物净化具有较好的处理效果。如研究发现沼液中氮、磷营养物去除率的高低与微藻的生长状况呈正相关[7]。但深入研究发现利用单一微藻处理沼液仍存在一定的应用局限性，具体表现为微藻个体微小，后期的藻体回收、分离困难，因藻体的分离回收而造成废水处理成本较高[8-9]。

本研究利用前期筛选出的具有高耐污性的优势微藻(小球藻和斜生栅藻)及真菌菌种(灵芝菌)，研究确定了微藻和灵芝菌形成共生体的最佳形成条件；并对光生物反应器中优势藻菌共生体净化沼液的影响因素进行了探究，确定了最佳光照条件和光周期变化，实现了沼液污染物去除效果的最优化。研究结论能为藻菌共生体在沼液生物净化中的技术应用提供理论基础。

1 实 验

1.1 仪器和试剂

实验涉及的仪器包括：XZ-21KT型高速冷冻离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；Unique-R20型多功能超纯水机，厦门锐思捷水纯化技术有限公司；FE28型pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；YXQ-LS-75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；UV-1800PC型紫外分光光度计，翱艺仪器(上海)有限公司；HCA-102型标准COD消解器，泰州市国瑞分析仪器厂；HZ-9310KBG型卧式光照摇床，太仓市华利达实验设备有限公司；GZP-250S型光照培养箱，上海精宏程控光照培养箱；SW-CJ-2D型超净工作台，苏州净化设备有限公司；QL-866型旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；MS204TS型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；GZX-9246MBE型电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ZDDN-Ⅱ型自动型凯式定氮仪，浙江托普云农科技股份有限公司；Primo Star型正置显微镜，卡尔蔡司股份公司。

实验所用材料和试剂包括：二甲基亚砜、葡萄糖、尿素、二水合磷酸二氢钠、三水合磷酸氢二钾、二水合氯化钙、七水合硫酸镁、重铬酸钾、邻菲啰啉、硫酸亚铁铵、浓硫酸、硫酸银、氢氧化钠、过硫酸钾、硝酸钾、抗坏血酸、钼酸铵、酒石酸锑钾(半水)、硝酸钠、丙酮、戊二醛、浓盐酸、冰乙酸、无水乙醇、乙二胺四乙酸二钠、苯酚、磷酸缓冲液、BG11培养基、PDA培养基。以上试剂均为分析纯，均购于上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 藻种培养

小球藻(Chlorellavulgaris)和斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)均购于中国科学院武汉水生生物研究所。选取标准BG11培养基，在光照培养箱中对藻种进行培养及扩培，培养及扩培条件：温度为(25±0.5)℃，pH为6.95±0.18，光强度为200 μmol/m2·s，光周期为12 h昼/12 h夜[12]。实验所用灵芝菌真菌菌种购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。菌株经PDA斜面培养基活化后，接入液体PDA培养基中，在28 ℃条件下摇床(160 rpm)培养3天，备用。

藻菌共生体的培养及扩培同样在光照培养箱中进行，温度为(25±0.5)℃，光照强度为200 μmol/(m2·s)，选择在驯化BG11培养基(BG11培养基+2%麦芽糖+0.5%酵母膏)中进行。取预先扩培后的小球藻培养液20 mL经离心后去除上清液，离心沉淀利用驯化培养基洗涤2次，然后接种于100 mL驯化BG11液体培养基中(计数)，同时接种不同的真菌菌液(计数)。保持12 h昼/12 h夜的光周期，到对数生长期再扩大培养，然后保存于储备液中备用。

1.3 沼液来源、预处理与理化特性

原沼液是来自江苏“宏茂农场”其发酵装置是利用猪粪和农业秸秆混合厌氧发酵产沼气。厌氧发酵装置所产沼液全部储存于池中，取沼液时利用塑料桶和麻绳将沼液从沼液池中分多次取出，然后装到塑料化工壶内带回实验室备用。

原沼液先过滤，以去除其中的沉积物及悬浮颗粒物，滤出沼液收集后再经过紫外线杀菌器处理5 min。经实验室分析测定，备用沼液水质指标如下：pH 6.83±0.22，COD(1212.24±37.65)mg/L，TN(96.38±6.31)mg/L，TP(21.05±1.98)mg/L。

1.4 实验设计

1.4.1 藻菌共生体的形成研究

在藻菌共生体的构建实验过程中，藻细胞(小球藻或斜生栅藻)接种量为2.0×107cell/mL，培养量50 mL，160 rmp，培养温度(25±0.5)℃，光照强度为200 μmol/m2·s，光周期设置12h昼/12h夜，藻-灵芝菌的比例(细胞数比例)设置为1:1、1:10、1:20、1:30，共培养7 d后借助显微镜考察不同藻菌配比条件下构建的藻菌共生体的大小与数量。随后，在最优藻菌比例的条件下，分别在转速100 rpm、160 rpm、220 rpm的条件下共培养7 d，考察共培转速对构建藻菌共生体的影响。

1.4.2 藻菌共生体净化沼液效果研究

实验在自主设计的罐式光生物反应器(图1)中进行，光照培养条件：温度(25±0.5)℃，速度160 rpm，光强度为200 μmol/(m2·s)。藻菌共生体(接种量为20%)由接种口引入光生物反应器，沼液经预处理后由沼液处理器泵入光生物反应器。

图1 实验光生物反应器装置

(1)不同混合光质对藻菌共生体处理沼液的影响

改变光生物反应器LED光源设置，选择单色红光、单色蓝光、红光：蓝光(3:7、5:5和7:3)五种光质，时间设置 12 h昼/12 h夜，实验处理7 d后测定处理后沼液中化学需氧量(COD)、总氮(TN)和总磷(TP)的浓度并计算去除率，每个实验重复三次。

(2)不同光周期对藻菌共生体处理沼液的影响

按照(1)优选的LED混合光质和藻菌共生体，光周期选择12 h昼/12 h夜、14 h昼/10 h夜、16 h昼/8 h夜，实验处理 7 d后测定处理后沼液中COD、TN、TP的浓度并计算去除率，每个实验重复三次。

1.5 实验分析方法及数据处理

在实验处理的不同阶段，从反应体系中取15 mL混合液样品，做离心处理(6000 rpm，10 min)。随后用一次性PES滤膜过滤上清液，滤液放入棕色玻璃容器中保存备用。依据标准方法测定COD、TN、TP[13]。

沼液处理前后COD、TN和TP的去除率利用公式(1)进行计算：

(1)

式中：R是沼液中污染物(COD、TN和TP)的去除率，%；CI为沼液处理前污染物浓度，mg/L；CF为实验处理不同阶段沼液中污染物的浓度，mg/L。

实验最终数据均为三个平行实验结果数据的平均值，运用Microsoft Excel 2011进行数据分析与处理。

2 结果与讨论

2.1 微藻-真菌共生体系的建立

2.1.1 藻菌比例变化对藻菌共生体形成的影响

藻菌共生体是藻和菌共同生长及结合在一起的共生体，在共生环境下菌和藻会存在相互制约，相互影响[14]。藻-菌体系共生培养7 d后，不同培养条件下构建的藻菌共生体的大小与数量结果见表1。

表1 不同比例下形成藻菌共生体的情况

从表1描述结果可以看出，当藻菌比例为1:1时，共生体系中真菌生长迅速，抑制了藻种的生长(体系显现黄色)，且不能形成藻菌球。随着菌种密度的提高，当藻菌比列为1:10时可形成相对大的菌丝球，但微藻的生长仍较弱(体系显现黄色)；随着菌种密度的进一步提高，藻、菌在共生体系中形成了同步生长现象(体系显现深绿色)，当藻菌比列为1:20时形成了大小均匀藻菌球；当藻菌比列为1:30，会造成共生体系中微藻密度过大从而抑制真菌生长，共生体系中无法形成藻菌球。综合考虑，1:20是藻菌共生体形成的较优比例，且成球效果最佳。

2.1.2 共培转速变化对藻菌共生体形成的影响

按照上述优选条件(藻菌比列为1:20)，选择了小球藻或斜生栅藻与灵芝菌分别在转速100 rpm、160 rpm、220 rpm条件下进行藻菌共生体的培养，实验结果如表2所示。

从表2描述结果可以看出，当共生体培养转速为100 rpm时，共生体系能形成藻菌球，但大小不均匀(3～10 mm)；当共生体培养转速为160 rpm时，藻、菌共生体系生长良好(体系显现深绿色)，且形成的藻菌共生球更加均匀(3～4 mm)；当共生体培养转速为220 rpm时，培养体系中真菌的生长受到抑制，共生体系中无法形成藻菌球。由此可见，共培时最优转速应控制在160 rpm，此时小球藻或斜生栅藻与灵芝菌均能很好的形成藻菌共生体，且藻菌球的大小均匀，颜色深绿。

表2 不同转速下形成藻菌共生体的情况

2.2 藻菌共生体净化沼液结果分析

2.2.1 光质变化对藻菌共生体处理沼液的影响

改变光生物反应器LED光源设置，选择单色红光、单色蓝光、红光：蓝光(3:7、5:5和7:3)五种光质，时间设置 12 h昼/12 h夜。在光生物反应器中通过接种藻菌共生体处理沼液，实验处理7 d后测定处理前、后沼液中COD、TN和TP的浓度并计算去除率(每个实验重复三次)，实验结果见表3。

表3 不同混合光质对藻菌共生体处理沼液的影响

微藻的繁殖能力在很大程度上取决于光的波长特性，Kim等[15]的研究认为选择合适的光源混合波长可以促进微藻的生长从而提高沼液中营养物质(COD、TN和TP)的消耗去除能力。

从表3数据可以看出，在两种藻-菌共生体系中光质变化对沼液的处理效果会产生显著的影响，其中混合光源的效果要好于单色光源，单色光源中单色红光的效果又好于单色蓝光。这主要是因为叶绿素和藻胆蛋白对混合光波的吸收效果更好[16]。采用栅藻-灵芝菌共生体处理沼液的体系中，沼液中COD、TN和TP的去除率均表现为红(5):蓝(5)>红(3):蓝(7)>红(7):蓝(3)>单色红光>单色蓝光；采用红(5):蓝(5)光源时，沼液中COD、TN和TP的去除率最高，分别为66.54%±5.69%、72.37%±6.11%、77.61%±6.21%。采用小球藻-灵芝菌共生体处理沼液的体系中，光质变化对沼液的处理效果(COD、TN)表现为红(5):蓝(5)>红(7):蓝(3)>红(3):蓝(7)>单色红光>单色蓝光；TP的去除率则表现为红(5):蓝(5)>红(3):蓝(7)>红(7):蓝(3)>单色红光>单色蓝光；采用红(5):蓝(5)光源时，沼液中COD、TN和TP的去除率最高，分别为71.36%±6.44%、76.24%±6.64%、79.25%±6.12%。相关研究认为微藻光系统I可以被蓝光激发，而与光系统I紧密相连的光系统II则主要被红光激发[16]。还有学者认为红光与微藻细胞固碳有关，蓝光与光合作用中甘油三酯积累酶的活性有关[17-18]。所以，当红光与蓝光的比例不合适时则会影响共生体系中微藻的光合速率，进而影响微藻的生物量[19]。而本研究结果表明，在采用不同比例的红蓝混合光源时，红(5):蓝(5)的效果最佳。此外，相比较而言小球藻-灵芝菌共生体处理沼液的效果优于栅藻-灵芝菌共生体。

2.2.2 光周期变化对藻菌共生体处理沼液的影响

选择小球藻-灵芝菌为优势藻菌共生体，在红光:蓝光=5:5时，光周期选择12 h昼/12 h夜、14 h昼/10 h夜、16 h昼/8 h夜，实验处理7 d后测定处理前、后沼液中COD、TN、TP的浓度并计算去除率(每个实验重复三次)，实验结果见表4。

表4 不同光周期对藻菌共生体处理沼液的影响

从表4数据可以看出，采用小球藻-灵芝菌共生体处理沼液的体系中，光周期变化对沼液的处理效果会产生显著影响，沼液中COD、TN和TP的去除率均表现为16 h昼/8 h夜>14 h昼/10 h夜>12 h昼/12 h夜>；其中当光周期为16 h昼/8 h夜时，沼液中COD、TN和TP的去除率最高，分别为73.68%±5.32%、77.05%±6.25%、79.36%±5.08%。这可能主要是因为充足的光照时间能促进共生体系的繁殖，从而促进沼液中污染物质的去除。

3 结 论

藻菌共生体在沼液净化方面展现出很好的发展前景。因此，本文围绕藻菌共生体的构建、优势藻菌共生体的筛选，以及藻菌共生体光生物反应器系统的调控与优化等方面进行了研究，研究结论如下：

(1)小球藻或斜生栅藻与灵芝菌的比例变化对藻菌共生体的形成会产生影响，从藻菌共生体的颜色、大小、形态看，1:20是藻菌共生体形成的最优比例；对于共生体培养转速的影响，160 rpm下小球藻或斜生栅藻与灵芝菌均能很好的形成藻菌共生体，且形成的藻菌球大小均匀，颜色深绿。

(2)在红光和蓝光的最佳光照波长比为5:5、光周期为14 h昼/10 h夜时，小球藻-灵芝菌形成的共生体对沼液的净化效果最佳，COD、TN和TP的去除率分别达到73.68%±5.32%、77.05%±6.25%、79.36%±5.08%。