柑橘大实蝇非典型气味受体基因的克隆、序列分析及组织表达模式

王兆祥，田晓丽，齐振华，桂连友，王福莲，张国辉

(1.长江大学 农学院，昆虫研究所，湖北荆州 434025；2.长江大学 生命科学学院，湖北荆州 434025；3.青岛邮局海关，山东青岛 266000)

嗅觉是大多数动物接收外界信息的一种重要感觉方式。它们利用嗅觉识别环境中的信息化合物，以此来调控它们的行为，如寻找食物源、定位配偶以及躲避天敌等。动物嗅觉机制研究的重大突破得益于1991年Buck和Axel[1]首次发现了哺乳动物气味受体基因(odorant receptor,OR)。哺乳动物的气味受体蛋白属于典型的G蛋白偶联受体家族，该家族的典型特征是具有7个跨膜区，氨基端位于膜外，羧基端位于膜内。这类气味受体蛋白着生于哺乳动物鼻腔嗅觉上皮组织嗅觉神经元树突膜上。一旦与气味分子结合，气味受体蛋白就利用G蛋白/cAMP信号通路把这种化学刺激信号转变为神经冲动信号进而调控动物相应的行为[2-4]。昆虫气味受体蛋白的发现远滞后于哺乳动物，昆虫中第1个气味受体蛋白是1999年才在黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)中发现的[5-7]。昆虫气味受体蛋白着生于昆虫触角和下颚须表面嗅觉感器内的嗅觉神经树突膜上[8-9]。虽然昆虫气味受体蛋白的跨膜结构与哺乳动物非常相似，但两者也具有明显不同[10-11]。第一，在细胞膜上的方向不同：昆虫气味受体蛋白的氨基端位于胞内，羧基端位于胞外，而哺乳动物气味受体蛋白的氨基端位于胞外，羧基端位于胞内。第二，昆虫气味受体蛋白是以异源二聚体形式作为一个功能单位，其中包括1个在进化上高度分化的气味受体蛋白ORx(用于识别特异性气味物质)和1个进化上高度保守的气味受体蛋白(odorant receptor co-receptor,Orco)，并且Orco只存在于昆虫中[12-13]。Orco本身并不直接与气味配体结合，也不具有气味识别的功能，但它可以与ORx构成阳离子通道，并能引导气味分子和ORx结合，促使信号传导形成[10,12]。研究表明，每种昆虫只有一种Orco,在不同昆虫种间高度保守，尤其是在氨基酸序列的羧基端[14-19]。近年来，大量的相关研究表明，对Orco的表达进行干扰将会导致昆虫嗅觉功能显著受损[20-24]。因此，对Orco进行有效干扰或破坏，将会严重影响昆虫对气味分子的感知，进而干扰到昆虫的取食、交配和产卵等重要的生命活动，这暗示Orco可以作为害虫防治的一个潜在靶标[17]。

柑橘大实蝇(Bactroceraminax)属双翅目，实蝇科，果实蝇属，大实蝇亚属[25]，其幼虫俗称“柑蛆”，是一种危害柑橘类果实的主要害虫[26]。该虫在中国、尼泊尔、不丹和印度的柑橘生产区广泛分布[25,27-28]，主要以幼虫在果实内取食进行为害，对柑橘果实的产量和品质造成重大影响[29]。由于柑橘大实蝇幼虫钻蛀危害，不易防治，因此人们将防控重点放在柑橘大实蝇成虫的防控上。众所周知，利用嗅觉来诱捕害虫是一个高效、环保的防治策略。因此，研究柑橘大实蝇的关键嗅觉基因不仅可以加深对柑橘大实蝇嗅觉的认知，同时也为研制高效引诱剂或驱避剂提供重要的理论依据。

本研究基于长江大学昆虫生理生化课题组已获得的柑橘大实蝇成虫转录组数据，采用RT-PCR技术克隆柑橘大实蝇Orco基因，并对其进行生物信息学分析，同时，通过实时荧光定量PCR技术检测该基因在雌雄成虫不同组织的表达特征，以期为柑橘大实蝇后续的嗅觉分子机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

昆虫样本：柑橘大实蝇取自长江大学农学院昆虫化学生态实验室的室内饲养种群[30]。分别收取1～3日龄雌雄成虫的触角、头(不含触角)、胸、腹、足、翅等组织，将收取的组织样本存放于 -80 ℃冰箱，备用。

试剂及仪器：MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、PremixTaqTM(LATaqTMVersion 2.0)、DL2000 DNA Marker、TB GreenTMPremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0均购自宝生物工程(大连)有限公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；pGEM-T easy vector，Promega；F-DH5α感受态细胞，唯地生物。Gel Doc XR+凝胶成像系统，T100TMPCR仪，Bio-Rad CFX connect Real-Time System,美国Bio-Rad公司。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取 柑橘大实蝇各组织总RNA使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取；第一链cDNA用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser合成。-20 ℃保存，备用。

1.2.2 柑橘大实蝇Orco基因的克隆鉴定 从柑橘大实蝇成虫转录组数据中获得Orco基因序列，通过NCBI网站BLAST序列比对鉴定，使用Primer 5软件设计基因全长验证引物(表1，酶切位点用下划线标示)克隆柑橘大实蝇Orco基因。以触角组织的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系( 25 μL)：cDNA模板 2 μL、PremixTaq(LATaqVersion 2.0)12.5 μL、上下游引物各 1 μL(10 μmol/L)、ddH2O 8.5 μL。反应条件:95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s， 72 ℃ 100 s，34个循环；72 ℃延伸5 min。将PCR产物用10 g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测正确后，使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。将回收的目的片段连接到pGEM-T easy vector,再转化至DH5α感受态细胞中并进行培养，挑取单克隆进行菌液PCR检测。菌液PCR检测后，使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0提取检测正确的质粒DNA送样测序。序列测定及引物合成均由北京六合华大基因科技有限公司完成。

1.2.3 柑橘大实蝇Orco基因的生物信息学分析 柑橘大实蝇Orco核苷酸序列利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找开放阅读框，通过DNAMAN 7.0软件推导氨基酸序列；利用Expasy的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质的理化性质；信号肽采用SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)服务器进行预测，同时运用TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对其跨膜域进行预测；利用NCBI获取已知昆虫Orco氨基酸序列，其氨基酸序列的多重比对由DNAMAN 7.0软件完成；选取鞘翅目、双翅目、鳞翅目、半翅目、膜翅目和直翅目共45种昆虫Orco氨基酸序列，运用MEGA 5.1软件中邻接法(NJ树)建立系统发育树，设置Bootstrap为1 000，并使用iTOL(https://itol.embl.de/)编辑进化树。

1.2.4 柑橘大实蝇Orco基因的组织表达分析 利用 Primer 5.0软件设计实时荧光定量PCR中使用的特异性引物(表1)，内参基因选用GAPDH。采用实时荧光定量PCR试剂TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)和Bio-Rad CFX connect Real-Time System检测Orco的组织表达水平。实时荧光定量PCR体系为25 μL：cDNA 模板 2 μL、上下游引物各1 μL(10 μmol/L)、ddH2O 8.5 μL、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)12.5 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，39个循环。设置2次生物学重复，每个生物学重复进行3次技术重复。用溶解曲线分析扩增产物，采用2-ΔΔCt法[31]对柑橘大实蝇Orco基因的相对表达量进行分析。

表1 引物信息

1.2.5 数据分析 采用SPSS 17.0软件进行数据统计分析。不同组织间的差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan’s检验分析，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 柑橘大实蝇Orco基因克隆与序列分析

柑橘大实蝇Orco开放阅读框全长1 431 bp，编码476个氨基酸(图1)，等电点为8.69，分子质量53.41 ku,不稳定指数为29.00，亲水性总平均值(GRAVY)为0.296，是稳定的疏水性蛋白，带负电荷的残基(Asp+Glu)总数为31，带正电荷的残基(Arg+Lys)总数为37。序列分析表明该基因编码的蛋白中无信号肽；跨膜结构分析表明，推导出的柑橘大实蝇Orco氨基酸序列含有7个跨膜结构域(7-TM)，分别为 TM-1= 40～62 aa、TM-2= 72～90 aa、TM-3= 131～153 aa、TM-4=185～207 aa、TM-5= 337～359 aa、TM-6= 374～396 aa、TM-7= 450～472 aa，并且氨基端位于膜内，羧基端位于膜外(图1，图2)。

终止密码子用星号显示；下划线标出跨膜结构域1-7(TM1-7)

跨膜结构域是红色的，里面是蓝色，外面是紫色

2.2 柑橘大实蝇Orco的系统进化分析

氨基酸序列比对结果(图3)表明，柑橘大实蝇Orco氨基酸序列与鞘翅目、双翅目、鳞翅目、半翅目、膜翅目和直翅目昆虫氨基酸序列有较高的相似性(68.19%、86.42%、65.15%、56.43%、63.84%和59.92%)，尤其是和双翅目昆虫的氨基酸序列一致性最高，而且在羧基端高度保守。基于不同目昆虫Orco的氨基酸同源序列构建系统发育树(图4)，发现同一目昆虫的Orco均聚为一支，符合进化关系。柑橘大实蝇Orco位于双翅目分支上，与桔小实蝇Bactroceradorsalis的BdorOrco和地中海实蝇Ceratitiscapitata的CcapOrco聚在一起，可知柑橘大实蝇与同为果实蝇属的桔小实蝇遗传距离较近，其次是地中海实蝇，与半翅目昆虫的遗传距离最远。

BminOrco.柑橘大实蝇Orco；TcasOrco.赤拟谷盗Orco(XP_008194693.1，鞘翅目)；DmelOrco.黑腹果蝇Orco(NP_001097687.1，双翅目)；McinOrco.腰带长体茧蜂Orco(AGI62937.2，膜翅目)；HarmOrco.棉铃虫Orco(ADQ13177.1，鳞翅目)；LmigOrco.东亚飞蝗Orco(ALD51504.1，直翅目)；LhesOrco.西部牧草盲蝽Orco(AFX73447.1，半翅目)。序列一致性.黑色=100%，绿色≥75%，紫色≥50%。跨膜结构域1～7 (TM 1～7)用线表示

紫色.鞘翅目；黄色.双翅目；黑色.鳞翅目；绿色.半翅目；粉色.膜翅目；蓝色.直翅目；ApisOrco.豌豆蚜(XP_001951646.2)；YsigOrco.锤胁跷蝽(AVO63533.1)；ClecOrco.温带臭虫(NP_001303637.1)；LhesOrco.西部牧草盲蝽(AFX73447.1)；AlucOrco.绿盲蝽(AHC72290.1)；OasiOrco.亚洲小车蝗(QAB43939.1)；LmigOrco.东亚飞蝗(ALD51504.1)；SgreOrco.沙漠蝗(AEX28371.1)；NvitOrco.丽蝇蛹集金小蜂(NP_001164465.1)；McinOrco.腰带长体茧蜂(AGI62937.2)；MmedOrco.中红侧沟茧蜂(ABM05966.1)；CcinOrco.北美麦茎蜂(NP_001310774.1)；AmelOrco.西方蜜蜂(NP_001128415.1)；MsexOrco.烟草天蛾(XP_030036707.1)；BmorOrco.家蚕(NP_001037060.1)；LbotOrco.葡萄花翅小卷蛾(AXF48755.1)；PoctOrco.绿头卷叶蛾(AJF23826.1)；EposOrco.苹淡褐卷蛾(ACJ12928.2)；AsegOrco.黄地老虎(AGS41440.1)；SlitOrco.海灰翅夜蛾(ABQ82137.1)；HvirOrco.烟芽夜蛾(PCG73648.1)；HarmOrco.棉铃虫(ADQ13177.1)；HzeaOrco.美洲棉铃虫(AAX14773.1)；PstrOrco.黄曲条跳甲(ACD40044.1)；AcorOrco.铜绿丽金龟(AKC58535.1)；HoblOrco.华北大黑鳃金龟(AEE69033.1)；HparOrco.暗黑鳃金龟(AEG88961.1)；OcomOrco.广聚萤叶甲(QEE83332.1)；AglaOrco.光肩星天牛(XP_018568191.1)；CbowOrco.大猿叶虫(ALR72547.1)；AquaOrco.榆紫叶甲(AJF94638.2)；DponOrco.中欧山松大小蠹(XP_019768125.1)；TcasOrco.赤拟谷盗(XP_008194693.1)；TmolOrco.黄粉虫(AJO62219.1)；AgamOcro.冈比亚按蚊(XP_312379.3)；AaegOrco.埃及伊蚊(NP_001345400.1)；CquiOrco.致倦库蚊(ABB29301.1)；CcapOrco.地中海实蝇(NP_001266301.1)；BdorOrco：桔小实蝇 (ACC86853.1)；MdomOrco.家蝇(AFH96944.1)；DbusOrco.醋果蝇(XP_017848171.1)；DpseOrco.拟暗果蝇(XP_001359364.3)；DsuzOrco.斑翅果蝇(SAL89172.1)；DmelOrco.黑腹果蝇(NP_001097687.1)；BminOrco.柑橘大实蝇

2.3 柑橘大实蝇Orco的组织表达模式

柑橘大实蝇Orco的组织表达谱(图5)显示，柑橘大实蝇Orco基因在成虫触角中的相对表达量显著高于其他组织，并且在雌成虫触角中的表达量显著高于雄成虫；在头部(不含触角)、胸、腹、足和翅中微量表达。

不同字母表示不同组织间差异显著(P<0.05，Duncan’s test),小写字母表示雌成虫，大写字母表示雄成虫

3 讨 论

本研究鉴定分析柑橘大实蝇非典型性气味受体基因BminOrco。昆虫Orco氨基酸序列羧基端的4个保守基序(conserved motifs)RSAIKYWVERHKHVVR, IFGNRL, WYDGSEEAK 和 FASVLGATVTYFMVLVQLK被认为是昆虫Orco家族的典型特征[22,32]。柑橘大实蝇BminOrco序列的羧基端也发现了这些保守基序(RSAIKYWVERHKHVVR (residues 325-340), IFGNRL (residues 400～405), WYDGSEEAK (residues 421～429)and FASVLGAVVTYFMVLVQLK (residues 458～476)，但BminOrco序列第4个基序的第8位氨基酸突变为缬氨酸(V)。前人的研究表明，昆虫气味受体蛋白的氨基端位于膜内，羧基端位于膜外[10,33]。BminOrco跨膜结构的分析结果显示，BminOrco的氨基端位于膜内，羧基端位于膜外(图2)。这一结果同已被试验证实的果蝇D.melanogaster和榕小蜂ApocryptabakeriOrco 的膜拓扑学(membrane topology)是一致的[11,34]。以上结果进一步说明昆虫气味受体蛋白不同于哺乳动物气味受体蛋白。

系统树分析显示，6个目昆虫的Orco被分成6个不同的组(图4)，来自相同目的昆虫总是聚在一起，说明昆虫Orco基因可能来自1个共同祖先，随后由于不同的选择压力产生了相应分化。然而，Orco在不同目昆虫间好像又可以实现功能同源，因为来自谷实夜蛾Helicoverpazea、地中海实蝇Ceratitiscapitata和冈比亚按蚊Anophelesgambiae的Orco在Orco(Or83b)缺陷的果蝇突变体中转基因表达后，该果蝇可以恢复对乙酸乙酯等气味的嗅觉反应[35]。昆虫Orco要实现在不同昆虫中的功能同源性，就必须保证其氨基酸序列的关键氨基酸或者结构域在不同昆虫种类中保持高度保守。序列多重比较的结果显示，昆虫Orco序列在羧基端高度保守，这暗示这段高度保守区域可能是Orco在不同昆虫中行使相同功能的保证。其中位于第6跨膜区和第7跨膜区之间的环被认为是Orco与ORx互作过程中不可或缺的区域[10]。位于第7跨膜区的酪氨酸(Y)(在家蚕BombyxmoriOrco位于464位Y464，在果蝇D.melanogasterOrco位于第478位Y478)被认为在ORx/Orco 复合体形成阳离子通道的过程中起了重要作用[36]。在柑橘大实蝇Orco中它位于第468位(Y468)。

组织表达模式的结果显示，BminOrco主要在柑橘大实蝇雌雄成虫触角中高度表达，这与许多昆虫Orco在组织中的表达分布情况相符合，推测是因为触角作为昆虫的主要嗅觉器官，其上分布着大量嗅觉感受器，在接收外界信息的过程中起着关键作用[14-19,37]。柑橘大实蝇BminOrco在头(不含触角)、胸、腹、足、翅等组织中仅微量表达，这种现象在其他昆虫中也有类似情况[15-19]。另外，昆虫Orco的表达还会受昆虫性别和发育时期的影响，如张帅等[14]对中红侧沟茧蜂Orco在成虫羽化不同时期的表达量进行研究时发现，雌雄成虫触角之间的表达量在羽化的不同时期差异比较大，而董钧锋等[16]对棉铃虫齿唇姬蜂Orco的研究中发现，该基因在雄蜂触角中的表达量是在雌蜂触角中表达量的8.0倍。本研究发现，BminOrco在雌成虫触角中的表达量高于雄成虫触角中的表达量，且二者之间差异显著。这是否意味着柑橘大实蝇雌成虫具有更多的嗅觉行为表现，需要进一步研究。

本研究从柑橘大实蝇成虫转录组数据中鉴定、克隆得到BminOrco基因，并对其进行生物信息学分析，通过实时荧光定量PCR明确该基因的组织表达谱，研究结果为进一步研究柑橘大实蝇Orco的结构和功能奠定一定的基础。