中国奶牛牛支原体流行病学调查分析

温 靖 李 丹 郭 婷 武春霞 周雅坪 田广原 罗玉霞 郝永清*

(1.内蒙古农业大学 兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，呼和浩特 010010；2.内蒙古自治区生态与农业气象中心，呼和浩特 010052；3.阿拉善左旗农牧区生态管理综合行政执法局，内蒙古 巴彦浩特 75300)

牛支原体(Mycoplasmabovis)从1960年被发现至今逐渐成为对中国乃至世界养牛业造成巨大损失的动物性病原体。虽然目前仍没有被列入重大疫病的名单，但是已经引起越来越多的重视。许多报道已经证明牛支原体病呈现世界性分布。由于抗生素的广泛使用，肺炎球菌、金黄色葡萄球菌等病原体得到了很大程度的控制。M.bovis对抗生素不敏感，临床诊疗过程中发现，M.bovis逐步成为引起犊牛肺炎的重要病原体。除此之外，M.bovis也可引起关节炎、乳腺炎、结膜炎和中耳炎[1]。据估测每年1/4到1/3的呼吸系统相关疾病可能与M.bovis感染有关[1]。

2008年，中国首次从犊牛肺脏中分离到M.bovis[2]。虽然已有一些关于M.bovis流行和爆发的报道，但国内尚无长期持续性、大规模监测M.bovis流行情况的研究。目前，关于M.bovis流行情况的相关研究多采用肺脏分离细菌或血清学方法进行检测[3-6]。虽然从病死犊牛肺脏中分离M.bovis，能够明确诊断M.bovis的感染情况，但从犊牛肺脏中分离M.bovis需要对犊牛进行剖检，难以在养殖场中大规模开展。另外由于采样个数较少，无法对M.bovis在整体牛群中流行情况进行精确评估。血清学方法相对前者虽然较为简便，但是由于M.bovis存在表面抗原变异，由急性感染转为慢性感染后血液中抗体水平下降，难以检测，易出现漏诊[7-8]。上述两种方法，均不能对无症状犊牛或携带M.bovis的牛群散毒情况进行整体评价。因此，寻找一简单易行的评估方法是很有必要的。

犊牛支原体肺炎的发病高峰在1～4月龄[1-2，10]，这个阶段犊牛的免疫系统尚未发育完全，M.bovis在鼻腔内定植可下行引发牛支原体肺炎。处于感染急性期和恢复期的病牛是M.bovis重要的传染源，M.bovis在犊牛呼吸系统定植后的2～6 d后开始通过上呼吸道和鼻腔排出M.bovis。感染M.bovis的病牛泪液、鼻腔分泌物、阴道分泌物、乳汁和精液均有可能携带M.bovis[10-15]。鼻腔是M.bovis定植的最主要的场所，鼻腔分泌物是最重要的M.bovis传播介质[5,8，10]。关于M.bovis在上呼吸道定植和排出的相关研究较少[16]。虽然M.bovis的定植并不直接导致动物发病，但在免疫力下降，通风换气不良，其他呼吸道病原微生物入侵等条件下，定植在鼻腔中的M.bovis可下行至肺脏，引发犊牛肺炎[11-12]。因此，通过鼻腔检测并评估M.bovis传播风险是可行的，为预防包括牛支原体肺炎、牛支原体乳房炎和牛支原关节炎的爆发吹响警报[3,5,17-18]，该方法也更容易被养殖户接受。因此，本研究针对中国六大区域的奶牛场的0～80日龄无症状犊牛通过采集鼻腔拭子进行了M.bovis流行情况调查，并分析M.bovis阳性率的时空分布规律，M.bovis阳性率与犊牛日龄的相关性，对中国奶牛养殖地区预防和控制牛支原体相关疾病的发生具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 样本采集与来源

2013—2019年，全国6个区域，西南区以重庆市、四川省、云南省为代表；华南区以广东省为代表；华东区以江苏省、安徽省、山东省为代表；华中区以河北省和山西省为代表；华北区以内蒙古自治区为代表；西北区以甘肃省、新疆维吾尔族自治区为代表。随机对这些区域内存栏奶牛数在5 000头以上的集约化养殖牧场的0～80日龄无症状犊牛进行鼻拭子采样。2013—2019年，上述地区不同牧场每年连续收集3个月的鼻拭子样品，每个月采样15份，3个月共收集45份。最终收集鼻拭子样品1 878份。

1.2 主要试剂

基础培养基：PPLO肉汤粉21 g，0.4%酚红2.5 mL，25%酵母浸液10 mL，充分溶解定容至800 mL，用1 mol/L NaOH调pH至7.6～7.8，121 ℃ 灭菌15 min，4 ℃可保存2周。

完全培养基：基础培养基使用时加入200 mL的灭活马血清、终浓度为100 U/mL的青霉素以及终质量浓度为1 g/L的丙酮酸钠。配制固体培养基时，高压前再加入10 g琼脂粉，灭菌后温度降至50 ℃时再加入后续的添加剂。

1.3 鼻拭子样品的收集

采用一次性无菌棉签深入鼻腔10 cm深度进行采样，采集的样品置-20 ℃冰箱冻存，集中全程冷链运输，在实验室进行细菌分离和PCR鉴定。

1.4 牛支原体的分离培养

实验室进行牛支原体分离培养方法参照文献[10]，将拭子在支原体液体完全培养基中培养48 h，然后均匀涂布支原体完全培养基平板。所有的培养物均在37 ℃的5% CO2条件下培养。如果连续培养10 d没有观察到典型的牛支原体菌落生长，则为阴性。观察到典型油煎蛋样牛支原体菌落，挑单菌落接种到液体培养基中增菌培养。

1.5 M.bovis的PCR鉴定

培养结束后离心收集菌体沉淀，用牛支原体DNA提取试剂盒(购于BIOMIGA公司)提取基因组进行PCR鉴定，使用美国典型培养物保藏中心(ATCC)M.bovis标准菌株PG45(保藏号25523)作为阳性对照。无菌水作为阴性对照。引物设计参照Pinnow等[19]M.bovis基因序列特异性引物(PpSM5-1，5’-CCAGCTCACCCTTATACATGA-GCGC-3’；PpSM5-2，5’-TGACTCACCAATTA-GACCGACTATTTCAC-3’)。

PCR反应总体系为25 μL：模板3 μL、2×Taq Master Mix 12.5 μL、对应上下游引物各0.5 μL、ddH2O 8.5 μL。经优化后PCR扩增条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火1 min；72 ℃延伸1 min，共32个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃条件下保存，电泳观察结果。

1.6 数据分析

对不同地区犊牛M.bovis阳性率的分析采用多重t检验。对不同年份，犊牛M.bovis阳性率的统计学分析采用One-way ANOVA。对于不同季节，M.bovis阳性的分析采用非配对t检验。判断相同年份不同季节，同一地点不同季节，M.bovis的阳性率的统计学分析采用Two-way ANOVA。采用Two-tailed分析判断犊牛M.bovis阳性率与日龄相关性。当P<0.05时，表示显著性差异，当P>0.05时，表示无显著性差异。

2 结果与分析

2.1 部分样品的M.bovis PCR检测

用M.bovis特异性引物PCR 检测犊牛鼻拭子DNA，结果所示612份鼻拭子样品均扩增出约442 bp大小的片段，与预期扩增片段相符(图1)。不同来源犊牛鼻拭子M.bovisPCR 检测结果见表2，阳性检出率为9.8%～54.1%。从上述的612份阳性病料中共分离得到83株易于在实验室长期培养的牛支原体。

M，DNA 标准DL2 000；1～19，鼻拭子样品1～19；20，M.bovis标准菌株PG45；21，空白对照。M， DL2 000 DNA Marker; 1-19, Nasal samples 1-19; 20, M.bovis standard strain PG45; 21, Blank control.图1 犊牛部分鼻拭子样品中牛支原体PCR检测Fig.1 PCR detection of of Mycoplasma bovis in nasal swab samples of calves

2.2 2013—2019年全国奶牛养殖六大地区犊牛M.bovis阳性率及其时空分布规律

全国奶牛养殖六大地区犊牛M.bovis阳性率检测结果见表2。2013—2019年，M.bovis阳性率平均值由高到低分别是西北区(38.7%)、华东区(35.6%)、华北区(33.6%)、华中区(30.8%)、华南区(29.9%)和西南区(27.1%)(图2 (a))。中国奶牛养殖地区M.bovis阳性率在30%～40%波动。经统计学分析发现，六大奶牛养殖地区M.bovis阳性率不具有显著性差异(P>0.05)。

(a)M.bovis阳性率的空间分布；(b)M.bovis阳性率的时间分布；(c)M.bovis阳性率的季节性分布；(d)季节和年份双因素对M.bovis阳性率的影响；(e)地区和季节双因素对M.bovis阳性率的影响。(a) Spatial distribution of M.bovis positive rate; (b)Time distribution of M.bovis positive rate; (c) Distribution of M.bovis positive rate in different seasons; (d) Effects of seasons and years on the positive rate of M.bovis; (e) Effects of regions and seasons on the positive rate of M.bovis.图2 2013—2019年中国六大奶牛养殖地区M.bovis阳性率时空分布Fig.2 Time and space distribution of positive rate of M.bovis in six major dairy farm areas from 2013 to 2019 in China

全国奶牛养殖地区犊牛M.bovis阳性率2013—2019年阳性率平均值为32.6%(图2 (b))。2013—2015年，M.bovis阳性率维持在40%以上，2013—2015年M.bovis阳性率平均值由高到低分别为2014年(48.6%)、2015年(48.1%)、2013年(47.0%)。2013—2015年M.bovis阳性率平均值为47.9%，三年间M.bovis阳性率无显著性差异。2016—2019年M.bovis阳性率下降，在20%～30%波动，由高到低分别为2019年(26.5%)、2017年(20.9%)、2016年(20.4%)、2018(16.7%)。2016—2019年M.bovis阳性率平均值为21.1%，四年间M.bovis阳性率无显著性差异。2013—2015年M.bovis阳性率显著高于2016—2019年(P<0.05)。表明M.bovis阳性率波动可能存在一定的周期性，需要进一步验证。

通过研究不同季节M.bovis流行情况发现，冬春季节(10～次年3月)M.bovis阳性率(33.9%)平均值略高于夏秋季节(4～9月)(31.3%)，但差异不显著(P>0.05)(图2(c))。针对季节和年份因素对M.bovis阳性率进行统计学分析，2019年冬春季节(34.6%)和夏秋季节M.bovis阳性率(22.5%)存在统计学差异(P<0.05)，其余年份不同季节M.bovis阳性率不存在显著性差异(图2(d))。除华南地区冬春季节与夏秋季节，M.bovis阳性率存在显著性差异外(P<0.05)，参与调查的华东、华北、西北、西南和华中地区，冬春季节和夏秋季节均不存在显著性差异(P>0.05)(图2(e))。

2.3 不同日龄犊牛与犊牛群中M.bovis阳性率的相关性分析

按照日龄对犊牛进行分组，分为0～20、20～40、40～60和60～80日龄组。对M.bovis流行情况进行研究，Two-tailed法分析发现M.bovis阳性率与犊牛日龄具有显著性关联(P<0.01)。其中0～20日龄组，M.bovis阳性率为7.4%。20～40日龄组，M.bovis阳性率为25.4%。40～60日龄组，M.bovis阳性率43.2%。60～80日龄组，M.bovis阳性率为54.5%(表3)。犊牛鼻腔中M.bovis阳性率与日龄呈线性正相关(Y=0.795 5X-7.175，R2=0.99)。表明随着犊牛日龄的增加，犊牛生活范围的扩大，接触、定植和感染牛支原体的风险增加。

表3 不同日龄组犊牛M.bovis阳性率分析Table 3 Analysis of positive rate of M.bovis in calves of different age groups

3 讨 论

病原学和血清学方法均已证明M.bovis目前在世界上和中国范围均广泛流行。Brice等[20]在早期研究中发现荷兰等国家的育肥牛场中M.bovis流行率高达20%以上，而仅有极少一部分牛是完全健康的。英国被检测的养殖场中，50%的场区有感染M.bovis的情况，被感染的牛群表现出生长性能下降等特点[20]。欧洲每年约有25%～33%的犊牛肺炎是由M.bovis引起的[20-21]。美国每年单个牛场M.bovis流行率甚至高达70%，M.bovis引起的牛呼吸道疾病和乳腺炎对美国造成巨大的经济损失[22]。日本流行率相对较低，只有平均4.8%的牧场发现存在M.bovis感染[23]。比利时的流行率也相对较低，检测的200个牧场中只有3个牧场发现M.bovis感染[24]。李岩等[25]在2013年对新疆地区15个规模化奶牛场中牛支原体的感染情况调查发现437份血清中牛支原体抗体阳性率为40.0%；44份肺脏、关节液、鼻腔黏液样本中牛支原体阳性率为40.9%。谢建华等[26]从2008年到2013年持续对重庆地区牛支原体感染情况检测发现，血清中抗体阳性率在40.3%～75.0%。其中奶牛养殖场(61.8%)高于规模化肉牛场(51.3%)高于散养户(44.7%)。郭澍强等[27]对银川地区12个规模化牛场的230份奶牛血清进行检测发现牛群平均阳性率为26.5%，牛场阳性率为100%。上述的研究结果表明牛支原体在中国规模化牛场中的流行十分普遍。

M.bovis可以引起乳房炎、肺炎和关节炎等疾病。目前，对M.bovis引起犊牛肺炎的调查多集中在某一牧场爆发犊牛肺炎后，通过对死亡病牛进行剖检，分离造成犊牛肺炎的病原或通过收集血清后利用免疫学方法检测抗牛支原体抗体，得到关于M.bovis在牧场中流行情况的数据。对比前两种方法，在牛鼻腔拭子或犊牛鼻液中分离、鉴定M.bovis，简便易行，可操作性强，易于被养殖户接受，可以在牧场中大面积推广。

本研究表明，2013—2019年M.bovis在中国集约化牧场长期流行。2013—2015年M.bovis阳性率无显著性差异，平均值显著高于2016—2019年M.bovis阳性率，提示M.bovis的传播和流行可能存在一定的周期性。2016—2019年M.bovis阳性率相对较低，可能与2013—2015年M.bovis流行期间，大量病畜淘汰和死亡，其余家畜均获得免疫有关。我国M.bovis感染情况高于日本和比利时等国，感染水平接近欧洲和美国。由于2020年新冠肺炎疫情影响，人员的流动和生物制品的运输受到影响，本实验室未收集到2020年牧场的送检样品。M.bovis在中国集约化牧场流行情况的长期监测受到了中断。摸清M.bovis传播和流行的周期性特点需要长期的、持续的进行M.bovis流行情况监测。本实验室会继续监测中国奶牛养殖地区M.bovis流行情况，为M.bovis的传播和流行的规律性研究提供数据支持。

从空间上，六大奶牛养殖地区M.bovis阳性率无显著性差别。虽然不同季节，M.bovis阳性率差异不显著，冬春季节M.bovis平均阳性率略高于夏秋季节。推断可能与低温有利于M.bovis在奶牛养殖场饲养环境中存活有关[28]。目前尚无媒介昆虫机械性携带M.bovis有利于其传播的报道。统计学结果也证实除华南地区以外，同一地区不同季节，M.bovis平均阳性率差异不显著。研究试图分析牧场中M.bovis阳性率与当地温度和湿度的关系，尚未发现任何统计学意义的结果。由于参与流行病学调查的牧场多为半开放圈舍，犊牛舍中的温度、湿度常年波动范围变化不大。故未将温度、湿度分析结果列出。

M.bovis为条件致病菌，长期定植于犊牛的上呼吸道中。M.bovis在牛群中阳性率随着日龄的增长而升高，在7～10 d中，M.bovis阳性率为1%以下，到80日龄时，M.bovis阳性率为60%～80%，总体阳性率32.6%。随着日龄的增长，犊牛的活动范围变大，接触M.bovis污染的水、饲料、器具和其他患病动物的机会增加，可能是阳性率增加的主要原因，且该结果与Soehnlen等[18]研究结果相同。

4 结 论

从2013—2019年，我国六大奶牛养殖地区犊牛鼻腔中M.bovis阳性率为9.8%～54.1%。不同地区，阳性率不同，但不具有显著性差异。其中2013—2015年M.bovis流行情况较为严重，阳性率显著高于2016—2019年。另外，不同季节M.bovis阳性率差异不显著，且M.bovis阳性率与犊牛日龄呈正相关。