基于网络药理学的大柴胡汤治疗2型糖尿病的作用机制研究

周江，杨佳，武建英

糖尿病是一种以胰岛素分泌不足或机体功能缺陷（障碍）而引发的以高血糖为主要特点的慢性代谢性疾病[1]。糖尿病的发病率逐年快速升高，国际糖尿病联合会报告指出，2017年全球糖尿病患者人数高达4.25亿，其中我国患者人数占比达26.8%，已成为继心血管疾病、癌症后危害人类身体健康的第三大类疾病[2]。糖尿病患者中，受胰岛素抵抗（IR）、胰岛β细胞功能障碍、遗传和环境等因素影响的2型糖尿病（T2DM）的患病率高达90%以上[3]，加之其所诱发的糖尿病酮症酸中毒、糖尿病肾病、视网膜病变等并发症，严重威胁人类健康。目前，临床上西医治疗T2DM主要方法为口服降糖药物和胰岛素，该方法虽有一定的效果，但远期疗效较差，且多数药物存在低血糖、消化道反应等多种副作用，因而寻找与开发安全、有效的T2DM治疗策略已成为21世纪亟待解决的关键科学、健康难题之一。

中医药治疗T2DM历史悠久，中药及复方毒副作用小，且其多成分、多靶点、作用多通路的特点使其在T2DM等复杂疾病的治疗中具有独特的优势。近年来，诸多学者对中医药治疗T2DM进行了大量的实验与临床研究，研究并开发了许多行之有效的治疗药物，中医药治疗T2DM的研究已成为当今热点之一[4]。大柴胡汤源自张仲景的《伤寒杂病论》，由柴胡、黄芩、大黄、枳实、半夏、白芍、大枣和生姜这8味中药组成，具有和解少阳、清泻阳明之功效，主要用于治疗少阳阳明合病[5]。现代药理研究表明，大柴胡汤可通过改善机体糖代谢和胰岛素抵抗等而发挥治疗T2DM的作用，但有关其治疗T2DM作用机制的研究鲜有报道[6,7]。

2007年英国学者Hopkins AL首次提出“网络药理学”的概念，因其整体性、系统性的研究特点与中医整体观相吻合，因而研究人员将其广泛应用于中医药领域的研究，尤其是应用于中药（复方）防病治病作用机制的研究[8]。本研究旨在运用网络药理学的技术与方法，对筛选获得的大柴胡汤治疗T2DM相关靶点进行生物信息学分析，明确大柴胡汤治疗T2DM的潜在作用机制。此外，通过构建“复方-药材-成分-靶点-通路”网络并对网络中节点的拓扑参数进行分析，明确大柴胡汤治疗T2DM的潜在关键成分，为深入研究大柴胡汤治疗T2DM的药效物质基础及作用机制提供参考，并为大柴胡汤的临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 大柴胡汤活性成分及其靶点筛选基于中药系统药理学分析平台（TCMSP）数据库（https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），分别以大柴胡汤组方药材名称（柴胡、黄芩、大黄、枳实、半夏、白芍、大枣和生姜）为关键词，收集并整理各药材的化学成分，并结合各成分的口服生物利用度（OB）和类药性（DL）两个参数，筛选OB≥30%且DL≥0.18的成分为大柴胡汤潜在活性成分[9]。在TCMSP数据库各成分的“Related target”项下收集并整理上述活性成分的相关靶点，并利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/），限定物种为人（homo sapiens），获得各成分靶点所对应的基因名、官方名称及UNIPROTKB号。

1.2 T2DM相关靶点收集以“Type 2 diabetes mellitus”为关键词，采用GeneCards数据库（http://www.genecards.org/）和OMIM数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，https://www.omim.org/），收集并整理T2DM相关靶点，并以“1.1”项下方法采用UniProt数据库对T2DM相关靶点进行标准化。

1.3 大柴胡汤治疗T2DM潜在作用靶点筛选采用Bioinformatics & Evolutionary Genomics平台（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）对“1.1”项下大柴胡汤相关靶点及“1.2”项下T2DM相关靶点进行比对分析并以韦恩图进行展示，获得二者共有靶点即为大柴胡汤治疗T2DM的潜在作用靶点。

1.4 大柴胡汤治疗T2DM靶点互作网络构建与分析采用STRING数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）构建“1.3”项下获得的大柴胡汤治疗T2DM靶点的蛋白-蛋白相互关系（PPI）网络，选定物种为人，设定minimum required interaction score为medium cofidence（0.400），获得大柴胡汤治疗T2DM靶点的PPI网络。将PPI网络相关数据文件导入Cytoscape 3.7.1软件，采用Network Analyzer插件计算网络中各节点的度数（Degree）、中介中心性（BC）和接近中心性（CC）三个主要拓扑参数，明确网络中相关重要节点。

1.5 大柴胡汤治疗T2DM靶点GO注释与KEGG通路分析采用DAVID 6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）对大柴胡汤治疗T2DM的靶点进行GO注释分析和KEGG通路分析，并以P＜0.05为筛选条件，明确靶点所涉及的生物学过程（BP），细胞组分（CC）、分子功能（MF）及其参与的信号通路，探讨大柴胡汤治疗T2DM的作用机制。

1.6 “复方-药材-成分-靶点-通路”网络构建与分析采用Cytoscape 3.7.1软件，构建“复方-药材-成分-靶点-通路”网络，并以“1.4”项下方法明确网络中节点的相关拓扑参数，明确大柴胡汤治疗T2DM的关键成分、靶点及通路，深入阐释其作用机制。

2 结果

2.1 大柴胡汤活性成分及作用靶点筛选结果以OB≥30%和DL≥0.18为标准，分别从大柴胡汤组方中药柴胡、黄芩、大黄、枳实、半夏、白芍、大枣、生姜中筛选出17、24、16、22、13、13、28和2个潜在活性成分，其中kaempferol、quercetin和beta-sitosterol等11个成分在组方药材2味及以上中药中所含有，删除各味中药中重复成分后共获得119个大柴胡汤潜在活性成分（表1）。

表1 大柴胡汤中潜在活性成分

成分ID 成分名称OB（%） DL 药材来源MOL001941Ammidin 34.55 0.22枳实MOL005849didymin 38.55 0.24枳实MOL000006luteolin 36.16 0.25枳实MOL001798neohesperidin_qt 71.17 0.27枳实MOL0051005,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one 47.74 0.27枳实MOL013433prangenin hydrate 72.63 0.29枳实MOL013430Prangenin 43.60 0.29枳实MOL0132795,7,4'-Trimethylapigenin 39.83 0.30枳实MOL0134376-Methoxy aurapten 31.24 0.30枳实MOL013436isoponcimarin 63.28 0.31枳实MOL013435poncimarin 63.62 0.35枳实MOL007879Tetramethoxyluteolin 43.68 0.37枳实MOL0090534-[(2S,3R)-5-[(E)-3-hydroxyprop-1-enyl]-7-methoxy-3-methylol-2,3-dihydrobenzofuran-2-yl]-2-methoxy-phenol 50.76 0.39枳实MOL013277Isosinensetin 51.15 0.44枳实MOL001803Sinensetin 50.56 0.45枳实MOL005828nobiletin 61.67 0.52枳实MOL013440citrusin B 40.80 0.71枳实MOL013428isosakuranetin-7-rutinoside 41.24 0.72枳实MOL013276poncirin 36.55 0.74枳实MOL013352Obacunone 43.29 0.77枳实MOL005030gondoic acid 30.70 0.20半夏MOL00693610,13-eicosadienoic 39.99 0.20半夏MOL006967beta-D-Ribofuranoside, xanthine-9 44.72 0.21半夏MOL00693712,13-epoxy-9-hydroxynonadeca-7,10-dienoic acid 42.15 0.24半夏MOL006957(3S,6S)-3-(benzyl)-6-(4-hydroxybenzyl)piperazine-2,5-quinone 46.89 0.27半夏MOL000519coniferin 31.11 0.32半夏MOL00175524-Ethylcholest-4-en-3-one 36.08 0.76半夏MOL003578Cycloartenol 38.69 0.78半夏MOL002670Cavidine 35.64 0.81半夏MOL000492(+)-catechin 54.83 0.24白芍、大枣MOL001928albiflorin_qt 66.64 0.33白芍MOL001918paeoniflorgenone 87.59 0.37白芍MOL00191011alpha,12alpha-epoxy-3beta-23-dihydroxy-30-norolean-20-en-28,12beta-olide 64.77 0.38白芍MOL001925paeoniflorin_qt 68.18 0.40白芍MOL001919(3S,5R,8R,9R,10S,14S)-3,17-dihydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-2,3,5,6,7,9-hexahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-15,16-dione 43.56 0.53白芍MOL001930benzoyl paeoniflorin 31.27 0.75白芍MOL000211Mairin 55.38 0.78白芍、大枣MOL001924paeoniflorin 53.87 0.79白芍MOL001921Lactiflorin 49.12 0.80白芍MOL001522(S)-Coclaurine 42.35 0.24大枣MOL008647Moupinamide 86.71 0.26大枣MOL012921stepharine 31.55 0.33大枣MOL012976coumestrol 32.49 0.34大枣MOL007213Nuciferin 34.43 0.40大枣MOL012992Mauritine D 89.12 0.45大枣MOL000627Stepholidine 33.11 0.54大枣MOL000783Protoporphyrin 30.86 0.56大枣MOL002773beta-carotene 37.18 0.58大枣MOL012940Spiradine A 113.52 0.61大枣MOL012989Jujuboside C_qt 40.26 0.62大枣MOL012961jujuboside A_qt 36.67 0.62大枣MOL012946zizyphus saponin I_qt 32.69 0.62大枣MOL003410Ziziphin_qt 66.95 0.62大枣MOL005360malkangunin 57.71 0.63大枣MOL012986Jujubasaponin V_qt 36.99 0.63大枣MOL004350Ruvoside_qt 36.12 0.76大枣MOL00803421302-79-4 73.52 0.77大枣MOL001454berberine 36.86 0.78大枣MOL012980Daechuine S6 46.48 0.79大枣MOL000787Fumarine 59.26 0.83大枣MOL012981Daechuine S7 44.82 0.83大枣MOL0061296-methylgingediacetate2 48.73 0.32生姜

采用TCMSP数据库，收集并整理上述119个潜在活性成分的作用靶点，共获得926个靶点，采用UniProt数据库对靶点进行注释和标准化，删除未能注释及重复靶点，共获得成分靶点143个。“活性成分-靶点”网络如图1所示（网络包含190个节点和979条边），对应靶点数较多的成分如quercetin（MOL000098，槲皮素，86个靶点）、kaempferol（MOL000422，山奈酚，54个靶点）、beta-sitosterol（MOL000358，β-谷甾醇，50个靶点）、Stepholidine（MOL000627，千金藤碱，45个靶点）、Stigmasterol（MOL000449，豆甾醇，44个靶点）等，表明这些成分可能是大柴胡汤发挥其药效作用的主要潜在有效成分。在143个成分靶点中，AR（androgen receptor, 雄激素受体）对应32个成分，ESR1（estrogen receptor α,雌激素受体α）对应31个成分，DPP4（dipeptidyl peptidase 4，二肽基肽酶4）对应28个成分，PPARG（peroxisome proliferator-activated receptor gamma, 过氧化物酶体增殖物激活受体γ）对应27个成分，这些靶点可能是大柴胡汤发挥其药效作用的主要潜在靶点。

图1 大柴胡汤“活性成分-靶点”网络图

2.2 大柴胡汤治疗T2DM潜在作用靶点筛选结果从GeneCards和OMIM数据库分别获得T2DM相关靶点496和182个，删除两个数据库重复靶点，共获得T2DM相关靶点636个。将大柴胡汤活性成分靶点与T2DM相关靶点相互映射并以韦恩图进行展示（图2），共获得交集靶点54个，即大柴胡汤治疗T2DM的潜在作用靶点，包括AR、ESR1、DPP4、PPARG、MAPK14、EGF、INSR和MAPK1等。

图2 大柴胡汤与T2DM共有靶点韦恩图

2.3 大柴胡汤治疗T2DM作用靶点PPI网络分析结果将54个大柴胡汤治疗T2DM的潜在作用靶点导入String数据库，获得靶点间的PPI网络如图3所示。采用Cytoscape 3.7.1软件计算网络的Degree、BC和CC三个主要拓扑参数，结果表明Degree、BC、CC三个拓扑参数的中位数分别为24、0.0066和0.6310。筛选网络中Degree、BC、CC三个参数均大于等于中位数的节点为核心节点，所对应的靶点即为大柴胡汤治疗T2DM的核心靶点，共获得核心靶点22个（表2），包括AR、ESR1、PPARG、IL-6、TNF、VEGFA和MAPK1等。

图3 大柴胡汤治疗T2DM潜在作用靶点的PPI网络

表2 大柴胡汤治疗T2DM的核心靶点信息

2.4 大柴胡汤治疗T2DM核心靶点GO注释与KEGG通路分析结果采用DAVID 6.8数据库对大柴胡汤治疗T2DM的核心靶点进行GO注释分析分析，结果如图4所示，22个核心靶点主要集中于细胞内部分（GO:0044424）、细胞内（GO:0005622）、细胞内细胞器（GO:0043229）、膜细胞器（GO:0043227）及器官部分（GO:0044422）等，涉及刺激反应的调节（GO:0048583）、细胞过程的正调控（GO:0048522）、生物过程的正调控（GO:0048518）、单一生物体信号（GO:0044700）、细胞对刺激的反应（GO:0051716）等生物学过程，发挥蛋白质结合（GO:0005515）、杂环化合物的结合（GO:1901363）有机环状化合物的结合（GO:0097159）、碳水化合物衍生物的结合（GO:0097367）及大分子复合物的结合（GO:0044877）等分子功能。

图4 大柴胡汤治疗T2DM核心靶点的GO注释分析

2.5 “复方-药材-成分-靶点-通路”网络分析结果采用Cytoscape 3.7.1软件构建“复方-药材-成分-靶点-通路”网络（图6），计算网络中节点的Degree，Degree排名前五的成分包括quercetin（MOL000098，槲皮素，Degree=21）、luteolin（MOL000006，木犀草素，Degree=14）、wogonin（MOL000173，汉黄芩素，Degree=12）、beta-sitosterol（MOL000358，β-谷甾醇，Degree=12）和kaempferol（MOL000422，山奈酚，Degree=12）；Degree排名前五的靶点包括MAPK14（Mitogen-activated protein kinase 14，Degree=55）、MAPK1（Mitogen-activated protein kinase 1，Degree=53）、TNF（Tumor necrosis factor，Degree=40）、MAPK8（Mitogen-activated protein kinase 8，Degree=38和ESR1（Estrogen receptor，Degree=35），表明上述成分和靶点可能在大柴胡汤治疗T2DM的过程中发挥重要作用。

图6 大柴胡汤治疗T2DM的“复方-药材-成分-靶点-通路”网络图

3 讨论

图5 大柴胡汤治疗T2DM核心靶点的KEGG通路分析（Top 30）

大柴胡汤组方药材较多，成分复杂，加之其药效多靶点、作用多通路的特点为其药效物质基础及作用机制的研究带来了巨大的挑战。网络药理学研究以系统生物学为基础，突破了传统西药研究所固化的“一药一靶一疾病”的研究模式，通过构建与分析“药物-靶点-疾病”间多层次、多角度、复杂的相互作用网络，深入、系统地揭示药物对疾病网络的干预和影响机制。网络药理学系统性、整体性的研究特点与中医整体观、辨证论治的思想理念相吻合，因而“网络药理学”一经提出，便迅速被用于中医药作用机制的研究并广泛推广[10]。本研究采用网络药理学的方法，通过构建与分析大柴胡汤与T2DM间复杂的相互作用网络关系，研究并确定大柴胡汤干预T2DM潜在的重要活性成分、关键靶点和关键信号通路。

“复方-药材-成分-靶点-通路”网络中，基于对网络节点拓扑参数Degree值的筛选，揭示槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、β-谷甾醇和山奈酚五个成分可能是大柴胡汤治疗T2DM的潜在关键活性成分。槲皮素、木犀草素、汉黄芩素和山奈酚均为黄酮类化合物，研究发现，槲皮素的摄入量与T2DM的患病率呈高度负相关，其对T2DM具有潜在的治疗作用[11]；此外，槲皮素可降低T2DM大鼠血糖，减轻大鼠外周胰岛素抵抗，对T2DM的治疗效果与二甲双胍一致[12]。木犀草素和汉黄芩素均可改善T2DM的胰岛素抵抗，减轻T2DM所诱发的视网膜病变、心肌损伤等副作用，对T2DM及其并发症具有确切的治疗作用[13]。山奈酚可有效降低T2DM大鼠血糖，调节糖脂代谢紊乱，其作用与其抗炎、抗氧化活性密切相关[14]。

本研究还揭示MAPK14、MAPK1、TNF、MAPK8和ESR1等可能是大柴胡汤治疗T2DM潜在关键靶点。MAPKs（丝裂原活化蛋白激酶）广泛参与机体信号转导，其家族成员包括p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPKs）、细胞外信号调节激酶（ERKs）和c-Jun 氨基末端激酶（JNKs），可介导机体炎症和氧化应激等病理、生理过程，与T2DM的发生发展密切相关[15]。MAPK14为p38 MAPKs成员之一，其在促炎性细胞因子等胞外刺激所引起的级联反应中起重要作用。研究发现在糖尿病大鼠的骨骼肌和L6细胞IR模型中MAPK14蛋白及mRNA水平显著下调。MAPK1在MAPK/ERK级联中发挥重要作用，通过调控MAPK/ERK级联反应，使相关转录因子发生磷酸化，调节T2DM患者血糖、机体氧化应激反应及生长因子等。TNF主要由巨噬细胞分泌，通过抑制胰岛素诱导的IRS1酪氨酸磷酸化和葡萄糖摄取而诱导脂肪细胞中的IR；其所诱导的IR可促使脂肪细胞中GKAP42蛋白发生降解。MAPK8和ESR1与胰岛β细胞的凋亡密切相关；ESR1因与妊娠期糖尿病的高度相关性使其成为临床孕早期妊娠期糖尿病诊断的生物学指标。

对大柴胡汤治疗T2DM的核心靶点通路分析结果表明，核心靶点所涉及的通路包括TNF信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、VEGF信号通路等。T2DM及其并发症的发生发展与机体免疫状态及其介导的炎症反应密切相关，基于免疫和炎症的T2DM及其并发症防治药物、策略的研发亦成为近年来T2DM防治相关研究的热点[16]。NOD样受体信号通路中Nod样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体是机体固有免疫系统的重要组成部分，作为慢性微炎症调节的关键分子调控机体炎性免疫反应并直接参与T2DM的病变过程，NLRP3的激活可导致糖尿病相关的血管功能障碍和促炎表型。研究表明，糖尿病肾损伤及脂代谢异常与NLRP3介导的炎症反应密切相关，其中p38 MAPK信号通路的活化是NLRP3作用发挥的关键信号[17]。Toll样受体信号通路调控先天免疫，可介导机体组织的还原-氧化平衡，导致机体促炎状态和胰岛素抵抗的发生；研究表明，Toll样受体4（TLR-4）的多态性和高表达与T2DM炎症反应受损密切相关。VEGF信号通路与糖尿病的微血管并发症密切相关，VEGF水平可表示糖尿病患者内皮功能障碍的严重程度。

综上，本研究采用网络药理学的方法对大柴胡汤和T2DM进行“复方-中药-成分-靶点-通路”网络构建及多维度分析，筛选获得大柴胡汤治疗T2DM的潜在关键活性成分、靶点及信号通路等信息；研究结果还表明大柴胡汤在直接干预T2DM病程的同时，对T2DM并发症亦有潜在治疗作用，可为扩大大柴胡汤的临床应用提供科学依据。