大连日本对虾5种流行病原体的调查

任雪，陈文博，丁勇，张赛赛，曾范双，韩雨哲，任同军*

（1.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连 116023；2.大连市现代农业生产发展服务中心，辽宁 大连 116023）

日本对虾（）俗称花虾、竹节虾等，对虾科（Penaeidae）、对虾属（），是一种适温性广、生长迅速、营养丰富的重要养殖品种。随着对虾养殖规模的日渐庞大，对虾病害频发，严重威胁对虾养殖业。

对虾血细胞虹彩病毒（SHIV）是一种易致病、高致死的新型虹彩病毒。受其感染的对虾出现空胃、空肠、肝胰腺发白和甲壳变软等症状，严重时死亡。白斑综合征病毒（WSSV）具有极强的传染性，极易感染虾类等甲壳动物，在对虾被感染后的3～7 d内，累计病死率可达100%。传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV），感染后对虾的典型症状表现为生长缓慢和表皮畸形等，病死率极高，现已被世界动物卫生组织（OIE）收录为甲壳类重要疫病之一。急性肝胰腺坏死病致病性副溶血弧菌（AHPND,VP）最初被称为早期死亡综合征（EMS），典型症状为肝胰腺萎缩发白、空胃空肠、甲壳变软和活力丧失等。虾肝肠胞虫（,EHP）是一种主要寄生于对虾肝胰腺中的专性细胞内的微孢子虫，病虾感染后出现生长缓慢甚至停滞、肌肉浑浊发白的症状，即“棉花虾”，还会增加细菌继发感染的风险。

目前，我国已有诸多省市开展了对虾易感病原体的调查，然而鲜有关于大连地区日本对虾病原体的报道。现对大连地区日本对虾病原的分布及检出情况进行了调查，可为研究制定大连市对虾养殖业的病害综合防控措施、推动水产养殖业健康发展提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2020年9月，在辽宁省大连市日本对虾主要养殖区域（图1）（瓦房店沙山、瓦房店仙浴湾、金州杏树屯、普兰店城子坦、金州石河、庄河大郑、庄河打拉腰和庄河青堆）采集成虾样本。依据随机采样的原则，从每个养殖区域中随机采集的20尾日本对虾样本用液氮冷藏，并迅速运回实验室。基因组DNA（gDNA）提取试剂盒等均来自广州艾基生物技术有限公司。

图1 大连市日本对虾主要养殖区域分布

1.2 方法

在无菌条件下，将对虾的鳃丝和肝胰腺研磨制成匀浆液，随后转移至无菌离心管中，保存于-20℃冰箱内。按照gDNA提取试剂盒的操作方法提取对虾组织DNA，利用Nanodrop 2000检测其浓度，并保存于-20℃冰箱内。

1.3 PCR检测

分别以SHIV、WSSV、IHHNV、VP和EHP检测结果呈阳性的DNA和无菌去离子水为模板，进行阳性对照和阴性对照扩增。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，阳性产物送至广州艾基生物技术有限公司测序，将测序结果与美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中相应的基因序列进行比对，进一步验证结果的准确性。

1.3.1 SHIV检测

采用套式PCR法检测样本。第一轮PCR反应体系（50μL）：2×Pro Taq Master Mix 5μL，待检DNA模板1.0μL，上下游引物（10 mmol/L）各2.0μL（表1），加灭菌水补足至50.0μL；第二轮PCR反应体系：将第一步扩增产物稀释100倍作为模板，再次进行扩增。第1轮扩增程序：95℃预变性3 min；95℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，进行35个循环；72℃延伸2 min，4℃保温。第2轮扩增程序：94℃预变性3 min；95℃30 s，59℃30 s，72℃20 s，进行35个循环；72℃延伸2 min，4℃保温。

表1 PCR扩增体系引物序列

续表

1.3.2 WSSV检测

采用《白斑综合征（WSD）诊断规程第2部分：套式PCR检测法》（GB/T 28630.2—2012）检测样本。PCR反应体系与SHIV检测相同。第1轮扩增程序：90℃预变性2 min；94℃4 min，55℃1 min，72℃2 min，进行1个循环；72℃延伸5 min，4℃保温。第2轮扩增程序：90℃预变性2 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，进行39个循环；72℃延伸5 min，4℃保温。

1.3.3 IHHNV检测

采用《对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）检测PCR法》（GB/T 25878—2010）检测样本。PCR反应体系与SHIV检测中的第一轮PCR反应体系相同。扩增程序：95℃预变性5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，进行35个循环；72℃延伸7 min，4℃保温。

1.3.4 VP检测

采用OIE 2.2.1（2018版）AP4套式PCR方法检测样本。PCR反应体系与SHIV检测中的第一轮PCR反应体系相同。第1轮扩增程序：94℃预变性2 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，进行30个循环；72℃延伸2 min，4℃保温。第2轮扩增程序：94℃预变性2 min；94℃20 s，55℃20 s，72℃20 s，进行25个循环；72℃延伸10 s，4℃保温。

1.3.5 EHP检测

采用套式PCR法检测样本。PCR反应体系与SHIV检测中的第一轮PCR反应体系相同。第1轮扩增程序：95℃预变性5 min；95℃30 s，58℃30 s，68℃45 s，进行30个循环；68℃延伸5 min，4℃保温。第2轮扩增程序：95℃预变性5 min；95℃30 s，64℃30 s，68℃20 s，进行20个循环；68℃延伸5 min，4℃保温。

2 结果与分析

2.1 日本对虾5种病原体的总体检出情况

从160尾日本对虾中获得157份鳃丝、肝胰腺样本（余下3份对虾提取组织DNA未成功）。其中用于检测SHIV、WSSV的样本取自日本对虾的鳃丝，IHHNV、VP、EHP的样本取自日本对虾的肝胰腺。检测结果见表2。由表2可见，WSSV是5种病原体中检出率最高的一种。

表2 8个地区日本对虾样本中SHIV、WSSV、IHHNV、VPAHPND和EHP的检测结果

2.2 不同地区日本对虾5种病原体检出情况

大连不同地区日本对虾SHIV和WSSV检出情况见表3，IHHNV、VP和EHP检出情况见表4。表中样本数为每20个样本能够提取DNA的样本数。

2.2.1 SHIV

由表3可见，除金州区杏树屯外，其余7个地区养殖的日本对虾体内均有SHIV检出。瓦房店沙山和庄河青堆阳性检出率最高，均为10.00%，其余5个地区检出率约5.00%。

2.2.2 WSSV

由表3可见，8个地区均有WSSV检出。庄河大郑的阳性检出率最高，为20.00%。

表3 大连不同地区日本对虾SHIV和WSSV检出情况

2.2.3 IHHNV

由表4可见，瓦房店仙浴湾的IHHNV阳性检出率最高，金州石河和庄河大郑次之，普兰店城子坦未见阳性样品检出，其余4个地区的阳性检出率约5.00%。

2.2.4 VP

由表4可见，庄河大郑、金州杏树屯和庄河青堆3个地区有VP阳性检出结果，阳性率分别为10.00%，5.26%和5.00%；其余5个地区则未见阳性样品检出。

2.2.5 EHP

由表4可见，EHP阳性检出率最高的地区为瓦房店沙山，高达25.00%，瓦房店仙浴湾和庄河大郑次之，其余5个地区的阳性率约5.00%。

表4 大连不同地区日本对虾IHHNV，VPAHPND和EHP检出情况

续表

3 讨论

3.1 SHIV防控措施

本次日本对虾病原体检出结果显示，SHIV检出率虽然不高，但在大连各日本对虾养殖区域内依然广泛存在。SHIV自2017年首次发现至今，感染原因、作用机制、治疗手段等方面尚未完全成熟，因此目前仍以预防为主。大连地区对虾养殖者应注意以下几点：（1）选购有检疫合格证或直营场的健康苗种；（2）加强对养殖水质的监控，水温、氨氮、机械刺激等都是诱发SHIV的重要因素，需定期为水体消毒，保证水体健康且稳定；（3）实时监控养殖对虾的状态，及时捞出病、死虾，同时采取有效措施防止其继续扩散。

3.2 WSSV防控措施

调查结果显示，各病原体中，WSSV阳性检出率最高。虽然对WSSV的研究已经深入到分子水平，但在我国各地均有检出，且无特效的治疗药物，这就要求养殖业者进行科学的管理。（1）对池塘、滤水、进排水设施等进行全面消杀，保证良好的养殖环境；（2）实时监控温度、溶解氧、氨氮和盐度等物理指标，保证水质稳定；（3）适当应用免疫刺激剂、疫苗等以增强对病毒的抗性，从而提高抗病力；（4）加强对WSSV的监测与防控，了解并掌握其流行特点及发生规律等。

3.3 IHHNV防控措施

调查结果显示，IHHNV存在但检出率普遍不高。IHHNV可通过垂直、水平2种传播方式扩散感染，感染后终生带毒，而且能感染任何生长阶段的对虾。目前，病毒性体疾病仍以预防为主，要结合大连当地对虾病原体的流行情况，选育、繁育真正的无特定病原体对虾，将对虾、饵料和水质这三者平衡在一个相对稳定的生态系统内，改善IHHNV检测技术，努力实现更加快速且精确检测的目标。

3.4 VPAHPND防控措施

调查结果显示，8个采样点中只有3个有阳性检出，总体上表现出较好的态势，但其仍会长期影响我国对虾养殖业的发展。因此，对VP的综合防控主要有以下几个措施：（1）在对虾饲料中添加有机酸、植物或植物提取物、疫苗等，以保护对虾肝胰腺、帮助其抵御寒冷以及提高其对抗副溶血弧菌的免疫力等；（2）改善对虾养殖环境，包括合理控制放养密度、实时监控水质、适当添加益生菌以及充分的曝气等，文献[22]表明，增加向池塘注水的频率可以降低对虾感染的概率；（3）将微生物管理策略和生态学理论充分应用于VP的预防上，把池塘微生物作为一个整体进行研究，而不是单单关注某一病原体，并把重点放在如何消除VP感染上，而不是如何控制其感染。

3.5 EHP防控措施

本次调查中，瓦房店沙山的EHP阳性检出率最高，达25.00%。感染EHP的对虾虽不致死，但会使对虾出现明显的生长迟缓、质量不均等现象。目前尚无有效的治疗方法，主要以预防为主。（1）务必加强对亲虾的检验检疫力度，进行实时监测，从源头上降低对虾感染EHP的风险；（2）放养前一定要做好彻底消杀，以杀灭一些有害的病原体，并对进排水设施以及排出的尾水进行全面消毒；（3）严格把控水质和放养密度，及时处理病死虾；（4）对鲜活的饵料进行消毒处理；（5）可通过适当添加微生态制剂等来提高对虾的抗病力与免疫力等，以确保对虾养殖业的健康可持续发展。

4 结论

2020年9月，大连地区养殖日本对虾的最主要流行病原体为WSSV，其次为EHP、IHHNV、SHIV、VP。此外，瓦房店沙山和庄河青堆的SHIV检出率最高，庄河大郑的WSSV和VP检出率最高，瓦房店仙浴湾和瓦房店沙山的IHHNV和EHP检出率最高。广大对虾养殖者，应在疫病源头上做好综合防控，避免水体污染、交叉感染、环境胁迫和病害大面积暴发等。