猪牙皂皂苷对痰瘀互结型缺血性中风模型大鼠的保护作用及机制研究

董娜娜 陈晓兰 邓铋莉 万静 谢树才 胡娟 罗晨月 曹国琼

中圖分类号 R965 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2022）09-1068-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.09.08

摘 要 目的 研究猪牙皂皂苷对痰瘀互结型缺血性中风（ISPBS）模型大鼠的保护作用，并探究其作用机制。方法 将119只大鼠随机分为正常组（生理盐水）、假手术组（生理盐水）、模型组（生理盐水）、尼莫地平组（阳性对照组，5 mg/kg）和猪牙皂皂苷低、中、高剂量组（3.21、6.42、12.84 mg/kg），每组17只。除正常组外，其余各组大鼠均采用高脂饲料饲养+线栓法复制ISPBS模型。测定或观察大鼠神经功能评分、脑组织含水量、脑组织病理形态学变化和血清中血液流变学指标[全血黏度、红细胞聚集指数、卡松黏度]、血脂四项[三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）]、炎症因子[白细胞介素1β（IL-1β）、IL-10、肿瘤坏死因子α（TNF-α）]及脑组织中氧化应激指标[丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）]变化情况，并测定脑组织中B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白表达情况。结果 与正常组比较，模型组大鼠神经功能评分、5项血清指标（TC、TG、LDL-C、TNF-α、IL-1β）、血液流变学指标和脑组织中MDA、NO含量以及Bax、caspase-3蛋白表达水平均显著升高（P<0.01），血清中HDL-C、IL-10水平和脑组织中SOD活性、Bcl-2蛋白表达水平均显著降低（P<0.01），脑组织出现核固缩、胞膜碎裂等明显病变。与模型组比较，各给药组上述指标均不同程度改善，其中猪牙皂皂苷高剂量组大鼠的上述指标变化差异均有统计学意义（P<0.01）。结论 猪牙皂皂苷对ISPBS模型大鼠具有较好的保护作用，其机制可能与减少氧化损伤、减少促炎介质的产生和抑制神经元凋亡有关。

关键词 猪牙皂皂苷;痰瘀互结型缺血性中风;氧化损伤;机制

Protective effect and mechanism of saponins from Gleditsia sinensis on ischemic stroke with phlegm and blood stasis model rats

DONG Nana，CHEN Xiaolan，DENG Bili，WAN Jing，XIE Shucai，HU Juan，LUO Chenyue，CAO Guoqiong（School of Pharmacy， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE To study the protective effects of saponins from Gleditsia sinensis on ischemic stroke with phlegm and blood stasis（ISPBS） model rats， and to explore its mechanism. METHODS Totally 119 rats were randomly divided into normal group （normal saline）， sham operation group （normal saline）， model group （normal saline）， nimodipine group （positive control group， 5 mg/kg）， G. sinensis saponin low-dose， medium-dose and high-dose groups （3.21， 6.42 and 12.84 mg/kg）， with 17 rats in each group. Except for normal group， other groups were all given high-fat diet+suture-occluded method to induce ISPBS model. The neurological function score， water content of brain tissue， pathological morphology of brain tissue， the changes of hemorheology indexes  （whole blood viscosity， erythrocyte aggregation index， Casson-viscosity）， four items of blood lipid [triacylglycerol （TG）， total cholesterol （TC）， low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C）， high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C）] and inflammatory factors in serum and oxidative stress indexes [malondialdehyde （MDA）， nitric oxide （NO）， superoxide dismutase （SOD）] in brain tissue were determined or observed in rats. The protein expressions of B lymphocytoma 2 （Bcl-2）， Bcl-2 associated X protein （Bax） and caspase-3 in cerebral tissue were also detected. RESULTS Compared with normal group， the score of nerve function， 5 kinds of serum indexes （TC， TG， LDL-C， TNF-α， IL-1β）， hemorheology indexes， the contents of MDA and NO and protein expressions of Bax and caspase-3 in cerebral tissue were all increased significantly in model group （P<0.01）. The levels of HDL-C and IL-10 in serum， SOD activity and protein expression of Bcl-2 in cerebral tissue were decreased significantly （P<0.01）， and obvious lesions such as nuclear pyknosis and cell membrane fragmentation occurred in brain tissue. Compared with model group， above indexes of administration groups were improved to different extents， among which there was statistical significance in above indexes of G. sinensis saponin high-dose group （P<0.01）. CONCLUSIONS Saponin from G. sinensis has a good protective effect on ISPBS model rats. Its mechanism may be associated with reducing oxidative damage， reducing the production of pro-inflammatory mediators and resisting neuronal apoptosis.

KEYWORDS   saponins from Gleditsia sinensis; ischemic stroke with phlegm and blood stasis; oxidative injury; mechanism

中风是全球致残和致死的主要原因之一，人口老龄化的加剧将导致中风发生率的升高[1]。据全球疾病负担研究数据显示，我国总体中风发病风险为39.9%，位居全球首位[2]。中医理论认为，中风是在内伤的基础上加上饮食不规律、情志不畅、过度疲劳等引起的脏腑阴阳失调[3];痰瘀互结是中风的主要病机和致病因素，痰浊、瘀血贯穿了中风发生发展的全过程[4]。因此，目前中医治疗中风的方法主要为祛痰和开窍。

猪牙皂为豆科植物皂荚Gleditsia sinensis Lam.的干燥不育果实，具有祛痰开窍、消肿散结之功效[5]。据2020年版《中国药典》（一部）记载，以猪牙皂为主药、配以鹅不食草和细辛制成的通关散，吹鼻可治疗痰浊阻窍所致的气闭神昏、牙关紧闭、不省人事等症[5]。研究表明，经鼻给药是药物到达大脑最快、最直接的途径，以该方式给药后药物可以无创方式通过血脑屏障[6]。本课题组前期研究了猪牙皂不同萃取部位经鼻给药后对缺血缺氧模型小鼠血脑屏障通透性的影响，发现芳香类成分和皂苷类成分具有较好的“通关开窍、醒脑复神”作用[7]。因此，本研究在前期研究基础上考察猪牙皂皂苷对痰瘀互结型缺血性中风（ischemic stroke with phlegm and blood stasis，ISPBS）模型大鼠的保护作用和可能机制，为猪牙皂皂苷鼻内给药制剂的研制和应用提供一定的实验依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用的主要仪器有Multiskan Mk3型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），BA200Digita型显微摄像系统（麦克奥迪实业集团有限公司），DZKW-4型恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司），LG-R-80B型血液黏度仪（北京中科富邦医疗设备有限公司），AUW12D型分析天平（日本Shimadzu公司）。

1.2 主要药品与试剂

本研究所用的主要药品与试剂有：猪牙皂皂苷（本实验室按文献[7]方法自制，1 g猪牙皂生药可以得到57 mg皂苷），尼莫地平片（亚宝药业集团股份有限公司，批号170606，规格20 mg/片），三酰甘油（triacylglycerol，TG）试剂盒、总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为A110-1-1、A111-1-1、A113-1-1、A112-1-1、A001-1、A003-1、A012），大鼠白细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒、大鼠IL-10 ELISA试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（上海茁彩生物科技有限公司，批号分别为ZC-36391、ZC-36379、ZC-37624），兔源B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）抗体（美国Santa Cruz公司，批号sc-492），兔源Bcl-2相关X蛋白（Bax）抗体、兔源半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）抗体（美国CST公司，批号分别为2772s、9662s），辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔/小鼠免疫球蛋白G（Ig G）二抗（武汉博士德生物工程有限公司，批号BST13J17B16G56），苏木精染液、伊红染液（武汉赛维尔生物技术有限公司，批号分别为G1005-1、G1001），磷酸盐缓冲液（PBS，北京索莱宝科技有限公司，pH 7.2～7.4），多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司）;其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为纯净水。

1.3 动物

本研究所用动物为SPF级SD雄性大鼠，共119只，体质量为250～280 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK（湘）2019-0014，合格证号为430726210100322185。所有大鼠均饲养于12 h光照/12 h黑暗、温度（25±1） ℃、相对湿度（50±10）%的动物房内，饲养期间自由摄食、饮水。实验前先适应性喂养7 d。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

将119只大鼠按照随机数字表法分成正常组（生理盐水）、假手术组（生理盐水）、模型组（生理盐水）、尼莫地平组（阳性对照组，5 mg/kg，剂量按药品说明书中成人剂量换算后制定）和猪牙皂皂苷低、中、高剂量组[3.21、6.42、12.84 mg/kg;剂量参考2020版《中国药典》（一部）猪牙皂成人每日用量（1～1.5 g），并按照体表面积法[8]换算成大鼠的每日用量]，每组17只。正常组大鼠采用普通饲料喂养;其余各组大鼠均给予高脂饲料（由3.5%胆固醇、10%猪油、0.2%丙硫尿嘧啶、0.5%胆酸钠、10%白糖、75.8%基础饲料组成）喂养[4，9]。大鼠饲养28 d后，眼眶取血，检测血液流变学指标及血脂四项的变化，若发现各指标均异常则认为痰瘀互结型大鼠造模成功[4]。正常組、假手术组、模型组和猪牙皂皂苷组大鼠通过鼻腔给予等体积生理盐水或相应药物，尼莫地平组大鼠灌胃给药，每天给药1次，连续7 d。末次给药1 h后，大鼠禁食不禁水12 h，采用线栓法建立ISPBS模型[10]。具体造模方法为：将大鼠麻醉，然后将其仰卧固定，从颈正中切口，继而分离右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）、颈内动脉（internal carotid artery，ICA），结扎CCA近心端以及ECA，在CCA距离ICA和ECA分叉口4 mm处剪小口;将鱼线插入ICA，缺血2 h后，将鱼线轻轻拔至分叉口，再灌注24 h。正常组大鼠不进行任何处理;假手术组大鼠仅分离血管，不插入鱼线及结扎，其余操作与各造模大鼠相同。在ISPBS模型制备过程中，有部分组别的少数大鼠造模不成功，故本研究最终每组筛选12只大鼠进行各指标测定。

2.2 神经功能评分

大鼠再灌注24 h后，采用Berderson评分法对大鼠神经功能进行评分：0分为正常，表示无神经功能缺陷;1分为提尾时左前肢弯曲;2分为向左侧转圈;3分为向左侧倾倒;4分为不能行走，即在无意识但疼痛刺激下会出现肢体活动。若评分为1～3分，则表示造模成功[11]。

2.3 脑组织含水量检测

大鼠再灌注24 h后，每组随机取6只大鼠，处死后，立即取出其脑组织，精密称定脑组织湿质量，然后置于105 ℃电热鼓风干燥箱内烘干，待干燥至恒重后再称定脑组织质量，并按公式计算脑组织含水量：脑组织含水量（%）=（脑组织湿质量-脑组织干质量）/脑组织湿质量×100%。

2.4 血清中血脂四项、炎症因子和血液流变学指标检测

大鼠再灌注24 h后，各组取剩余6只大鼠，麻醉后自眼眶取血2 mL，4 ℃静置30 min，以3 000 r/min离心10 min，分离血清。根据试剂盒说明书方法测定血清中血脂四项（TC、TG、LDL-C、HDL-C）和炎症因子（IL-1β、IL-10、TNF-α）水平。另外，于大鼠腹主动脉取血5 mL，4 h内用血液黏度仪进行血液流变学指标检测。

2.5 脑组织中氧化应激指标水平检测

采用ELISA法进行测定。取“2.4”项下取血后的大鼠，处死后，立即取出其缺血侧脑组织，一部分保存于  -80 ℃冰箱中，待用;另一部分于冰浴下制成10%脑组织匀浆，在4 ℃下以3 000 r/min离心10 min，取上清液，根据相应试剂盒说明书方法测定缺血侧脑组织中MDA、NO含量及SOD活性。

2.6 脑组织病理形态学变化观察

采用苏木精-伊红（HE）染色法进行观察。取“2.5”项下冷冻的脑组织适量，固定于4%多聚甲醛中，常规制备石蜡切片（4～6 μm）并行常规HE染色，然后将切片置于显微镜下观察脑组织的病理形态学变化。

2.7 脑组织中Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表达检测

采用免疫组化法进行测定。取“2.5”项下冷冻的脑组织适量，固定于4%多聚甲醛中，经脱水、修剪、包埋、切片（4～6 μm）及二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，以过氧化氢浸泡;湿盒中加入Bax、Bcl-2、caspase-3一抗（稀释比例均为1 ∶ 200），4 ℃孵育过夜;加入HRP标记的山羊抗兔/小鼠IgG二抗（稀释比例均为1 ∶ 200），37 ℃孵育20 min;PBS冲洗，二氨基联苯胺（DAB）显色，蒸馏水洗涤，苏木精复染，二甲苯透明，中性树胶封片。最后采用显微摄像系统对切片进行图片采集，通过Image J 1.42软件分析样本的平均光密度值（平均光密度值越高表示蛋白表达越强）。

2.8 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.01。

3 结果

3.1 猪牙皂皂苷对模型大鼠神经功能评分的影响

与正常组比较，假手术组大鼠神经功能评分差异无统计学意义（P>0.01），模型组大鼠神经功能评分显著升高（P<0.01）;与模型组比较，尼莫地平组和猪牙皂皂苷高剂量组大鼠的神经功能评分均显著降低（P<0.01）。结果见表1。

3.2 猪牙皂皂苷对模型大鼠脑组织含水量的影响

与正常组比较，假手术组大鼠脑组织含水量差异无统计学意义（P>0.01），模型组大鼠脑组织含水量显著升高（P<0.01）;与模型组比较，各给药组大鼠脑组织含水量均显著降低（P<0.01）。结果见表1。

3.3 猪牙皂皂苷对模型大鼠血脂四项的影響

与正常组比较，假手术组和模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平均显著升高（P<0.01），HDL-C水平均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，尼莫地平组、猪牙皂皂苷高剂量组大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平均显著降低（P<0.01），HDL-C水平均显著升高（P<0.01）;猪牙皂皂苷中剂量组大鼠血清中TG、LDL-C水平均显著降低（P<0.01）。结果见表2。

3.4 猪牙皂皂苷对模型大鼠血液流变学的影响

与正常组比较，假手术组和模型组大鼠在各切变率下的全血黏度、红细胞聚集指数和卡松黏度均显著升高（P<0.01）;与模型组比较，各给药组大鼠在各切变率下的全血黏度、红细胞聚集指数（除猪牙皂皂苷低剂量组外）、卡松黏度均显著降低（P<0.01）。结果见表3。

3.5 猪牙皂皂苷对模型大鼠血清中炎症因子的影响

与正常组比较，假手术组大鼠血清中TNF-α、IL-10、IL-1β含量差异均无统计学意义（P>0.01）;模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量显著升高（P<0.01），IL-10含量显著降低（P<0.01）。与模型组比较，尼莫地平组、猪牙皂皂苷高剂量组大鼠血清中TNF-α含量均显著降低（P<0.01），IL-10含量均显著增加（P<0.01）;各给药组大鼠血清中IL-1β含量均显著降低（P<0.01）。结果见表4。

3.6 猪牙皂皂苷对模型大鼠脑组织中氧化应激指标的影响

与正常组比较，假手术组大鼠脑组织中MDA、NO含量和SOD活性差异均无统计学意义（P>0.01）;模型组大鼠脑组织中MDA、NO含量显著增加（P<0.01），SOD活性显著降低（P<0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠脑组织中MDA、NO（除猪牙皂皂苷低剂量组外）含量均显著降低（P<0.01），尼莫地平组、猪牙皂皂苷高剂量组大鼠脑组织中SOD活性均显著升高（P<0.01）。结果见表5。

3.7 猪牙皂皂苷对模型大鼠脑组织病理形态学变化的影响

正常组、假手术组大鼠脑组织形态结构正常，神经细胞排列规则、核轮廓清晰，神经纤维结构完整、排列紧密。模型组大鼠脑组织形态不完整，细胞核固缩或溶解消失，胞膜碎裂，神经纤维松散、排列杂乱，脑组织病变较严重。猪牙皂皂苷低、中剂量组大鼠脑组织神经细胞结构破坏，部分细胞核固缩或溶解消失，神经纤维较松散。尼莫地平组和猪牙皂皂苷高剂量组大鼠脑组织病理改变较模型组均明显减轻，神经细胞形态较为完整，神经纤维结构完整、排列紧密，仅可见少量被不同程度破坏的细胞。结果见图1。

3.8 猪牙皂皂苷对模型大鼠脑组织中Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表达的影响

与正常组比较，假手术组大鼠脑组织中Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.01）;模型组大鼠脑组织中Bax、caspase-3蛋白表达水平显著升高（P<0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P<0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠脑组织中Bax蛋白表达水平（除猪牙皂皂苷低剂量组外）均显著降低（P<0.01）;尼莫地平组和猪牙皂皂苷高剂量组大鼠脑组织中Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P<0.01），caspase-3蛋白表达水平显著降低（P<0.01）。结果见表6、图2。

4 讨论

尼莫地平是一种选择性较强的二氢毗陡类有机钙拮抗剂，易于透过血脑屏障，临床上主要用于脑血管灌流不足、脑血管痉挛、蛛网膜下腔出血等脑血管疾病的治疗[12-14]，目前被认为是预防和治疗脑血管疾病的首选药物[15]，因此本研究将其作为阳性对照药物。

现代医学认为，ISPBS的发生发展和血脂代谢、血液流变学异常密切相关。血脂代谢异常主要表现为TG、TC、LDL-C水平异常升高和HDL-C水平异常降低，可引发血液流动性、血液黏度、红细胞膜渗透性等异常改变，出现中医理论上“痰瘀致病”的病理变化，进而诱发中风[16-17]。在本研究中，ISPBS模型大鼠的血脂和血液流变学指标异常，符合痰瘀互结证的病理特征;猪牙皂皂苷能降低模型大鼠在各切变率下的全血黏度、红细胞聚集指数、卡松黏度以及血清中TG、TC、LDL-C水平，升高血清中HDL-C水平。这提示猪牙皂皂苷具有改善ISPBS模型大鼠血液流变学、调节其血脂代谢的作用。

脑中风患者的脑损伤是一个快速级联反应，包括炎症反应、氧化应激、凋亡基因激活、细胞内钙离子超载、兴奋性氨基酸毒性增加等[18]。炎症反应是脑缺血再灌注后继发性损伤的重要诱因和发病机制[19-20]。脑缺血发生后会引起炎症细胞活化和TNF-α、IL-1β等促炎因子分泌，进一步加重炎症反应和神经细胞损伤[21]。IL-10作为一种多功能炎症负调控因子，可抑制炎症反应的扩散，能一定程度保护神经细胞免受伤害，具有神经保护作用[22]。本研究结果显示，猪牙皂皂苷能降低ISPBS模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平，升高血清中IL-10水平。这提示猪牙皂皂苷可以通过抑制IL-1β、TNF-α分泌和促进IL-10释放，进而起到抗炎的作用。

氧化应激是脑缺血再灌注后继发性损伤的主要发病机制，也是该领域研究热点之一[23-24]。在脑缺血的不同时期，NO以不同的方式改善脑组织损伤及神经细胞的凋亡[25]。脑缺血发生后，缺血区域产生大量自由基，自由基攻击细胞膜引起脂质过氧化反应，从而产生大量代谢产物（如MDA）。因此，测定脑组织中MDA含量可间接反映脑组织损伤程度[26]。SOD是重要的过氧化物分解酶，可有效清除氧自由基，从而抑制脑组织的过氧化反应，保护脑组织[25]。本研究结果显示，猪牙皂皂苷能降低ISPBS模型大鼠脑组织中MDA、NO含量，升高其脑组织中SOD活性。这提示猪牙皂皂苷可通过抑制MDA、NO生成和促进SOD产生，从而减少过氧化反應引发的脑组织损伤。

在哺乳动物体内发现的14种caspase中，有8种被认为参与了细胞的凋亡过程，其中caspase-3被认为在凋亡过程中占主导地位，是最关键的凋亡蛋白酶[27]。Bcl-2和Bax蛋白是具有调控细胞凋亡作用的一对重要的内源性蛋白，Bax作为一种转录因子参与诱导细胞凋亡的基因转录过程，Bcl-2则可抑制Bax的作用，二者共同决定细胞的生存情况[28]。这提示猪牙皂皂苷能下调ISPBS模型大鼠脑组织中Bax、caspase-3蛋白表达并上调Bcl-2蛋白表达。上述结果提示，猪牙皂皂苷可以抑制神经元凋亡从而改善脑组织损伤。

5 结语

猪牙皂皂苷对ISPBS模型大鼠具有一定的保护作用，其机制可能与减少氧化损伤、减少促炎介质的产生和抑制神经元凋亡有关。但是，本研究仅初步探讨了猪牙皂皂苷抗ISPBS的作用及可能机制，其更多的作用机制以及具体是哪种成分起作用等问题均需要进一步深入研究。

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（收稿日期：2021-10-26 修回日期：2022-04-02）

（编辑：林 静）