精浆胞外囊泡对精子功能的作用研究进展

徐志谦，谢言射，蔡更元，吴珍芳，黄思秀*，洪林君*

（1.华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642；2.国家生猪种业工程技术研究中心，广东广州 510642）

精子功能是衡量雄性生殖能力的重要指标，研究精子功能对雄性经济动物生产性能的发挥和男性生育能力的检测诊断具有重大意义。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）资料显示，不孕不育是影响人们生活质量的重要疾病之一，在不育相关因素中，男性相关的原因占50%。据经合组织-粮农组织（OECD-FAO）预测，到2027 年，全球肉类需求量将增长15%，保证这种增长离不开利用生物技术来提高畜禽的生产性能，尤其提高畜禽的繁殖水平。精液中的精浆对精子功能具有重要作用，精浆可作为携带精子的介质并为其提供营养，在精液凝固和液化以及精子运动和受精中起着重要作用，精浆还可以调节精子的功能及其在雌性生殖道中的生理活动，尤其是雌性生殖道免疫系统的相互作用。本文综述了精浆中的胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）在精子功能中的研究进展，以期拓展精子功能调控相关的认识，为提高雄性动物繁殖力以及为男性不孕不育相关疾病治疗提供参考。

1 精子受精能力形成的生理过程

精子一般由睾丸中未分化的精原细胞发育而成，睾丸中生成的精子由曲细精管进入附睾，在附睾中经历形态上的变化，从而成为初步成熟的精子。附睾不同区域具有不同的生理环境，它们在精子通过附睾的过程中与精子相互作用，逐渐使精子具备完全受精能力，一些生理或病理性疾病引起的附睾功能障碍会影响精子的质量和功能，进而可能影响生育能力。当精子被射出后，精子与雄性生殖道性腺分泌的精浆混合在一起。精浆中含有大量的成分如无机离子、糖、有机盐、电解质和蛋白质，这些成分会进一步重塑精子质膜，改变精子的生理状态，对精子受精能力产生影响；同时，精浆中的一些成分还可以结合到精子细胞膜上，对精子产生保护作用，如精浆中的蛋白质在射精时可结合到精子表面，精子膜的蛋白质结构域也会因此发生改变，从而影响精子的受精功能。当精子进入雌性生殖道后，便开始为精卵结合做准备。在这个过程中，精子中的凝集素和纤连蛋白等蛋白可将精子结合到子宫上皮细胞，一方面可使精子储备在这个部位，另一方面也可使精子避免被雌性生殖道免疫细胞攻击清除。当雌性排卵时，输卵管上皮细胞释放排卵相关信号，促使精子获能和超激活，并游近卵母细胞然后穿透卵母卵丘细胞复合体。最后，精子与透明带结合，发生顶体反应，最终进入卵母细胞完成受精过程。对于雄性动物来讲，睾丸中精子发生、附睾精子成熟以及性腺分泌的精浆对精子的调控是影响精子功能的重要方面，也是研究雄性生育能力的几个重要切入点。

2 EVs 概述

EVs 最早在网织红细胞转向成熟红细胞发生的非特异性的细胞释放囊泡到细胞外的生理过程中观察到，被认为是细胞丢弃膜蛋白的一种机制。随着研究的深入，研究者发现EVs 不仅只是细胞排出废弃物的一个载体，还是细胞间通讯的重要介质，比如EVs 参与核酸、蛋白质及脂质等物质转运，以及作为正常细胞间稳态或非正常细胞病理情况的一个信号传导载体。但目前学术界对于EVs 还没形成统一的分类及命名方法，一般根据其囊泡直径大小可大致分为外泌体（Exosome）、微囊泡（Microvesicle）和凋亡小体（Apoptotic Body），其中外泌体直径一般在30～150 nm，微囊泡在100 nm～1 μm，凋亡小体1～5 μm。不同EVs 产生的方式不同，外泌体一般是由细胞通过向内芽生方式形成有膜包被的内体小泡，进而成为多囊泡体（Multivesicular Bodies，MVBs），多囊泡体再通过与细胞膜融合将其所含囊泡释放至胞外，从而生成外泌体；而细胞膜直接通过向外芽生方式形成小泡则称为微囊泡；凋亡小体则主要是一种细胞凋亡过程中向外释放的一类EVs。EVs 在体内主要参与介导细胞间的信息交流及调控作用。过去研究者认为细胞间交流通讯包括3 种机制：第一种是通过膜结合信号分子（如受体）或细胞间间隙连接的接触依赖性信号传导机制，第二种是通过分泌可溶性分子（如细胞因子和趋化因子）的短距离旁分泌形式的信号传导机制，第三种是基于激素信号作用进行调节的长距离内分泌信号传导机制。近年来随着对EVs研究的深入，研究者发现EVs 可携带miRNA、蛋白质、脂质等调节因子到达受体细胞，发挥细胞间的交流作用。由EVs 介导的细胞间交流主要通过激活细胞膜表面受体、囊泡内吞或与细胞膜融合等形式发挥作用。

3 精浆胞外囊泡（Seminal Plasma Extracellular Vesicles，SP-EVs）的组分及功能

精子的成熟、获能及受精是一个复杂的生理过程，需要体内不同器官间以及细胞间的高度交流和协调。Χu 等在雄性生殖道及其附属性腺腺体分泌物中证实了EVs 的存在。研究认为，精液中含有大量EVs，来自于精囊腺、附睾、前列腺和尿道球腺等雄性生殖系统腺体的分泌物，这些来源于雄性生殖道的各种EVs 统称为SP-EVs。人SP-EVs 平均数量约为10个/mL精液，粒径大小在50～250 nm；猪精液中的SP-EVs密度在1.7×10个/mL 左右，粒径大小＜300 nm；牛精液中SP-EVs 密度在1.1×10～1.3×10个/mL，粒径大小在120～200 nm。

研究者已经认识到SP-EVs 在体内参与精子的成熟过程，以及精子获能、顶体反应和受精等过程，但对精浆中这些EVs 如何生成、不同物种间的生理功能及其作用方式仍未阐明，目前对SP-EVs 的研究主要针对来源于附睾和前列腺的EVs。其中附睾产生的EVs 一般被称为附睾小体（Epididymosomes），主要由附睾上皮细胞的边缘形成细胞质凸起从细胞分离后再分解释放附睾小体，然后进入附睾腔内环境中。前列腺产生的EVs 一般称为前列腺小体（Prostasomes），主要由MVB 与腺泡细胞质膜融合后所释放，是最早在精液中发现与精子成熟及功能相关的囊泡状物质，其直径在50～500 nm，并且其中含有蛋白质、脂质及核酸等物质。SP-EVs 的结构示意图见图1。

图1 SP-EVs 的结构示意图

3.1 附睾小体对精子功能的作用 在附睾中，附睾小体与精子细胞膜的生理变化有很大关系，如它与精子磷脂组成改变、胆固醇/磷脂比率变化、总负电荷的增加及膜表面蛋白的修饰都有关系，而这些变化与精子成熟有重要关系。1985 年，研究者对中国仓鼠附睾分泌的附睾小体进行研究，人们首次对这一物质有了系统的认识。研究者在中国仓鼠中发现附睾头部后侧的精子上存在着直径20～100 nm 的囊泡状膜泡，这些膜泡富含胆固醇，它与精子的顶体区域结合，因此人们认为它与精子细胞膜胆固醇的转移有关。

附睾小体携带去能相关因子，可以促进精子在附睾中的移动并防止精子过早获能。目前研究者们已在附睾小体中发现了许多功能性物质。其中研究者在小鼠中通过液相色谱并结合串联质谱标签定量对小鼠SPEVs 进行蛋白质组学分析，共发现1 640 个附睾小体蛋白，且蛋白在附睾不同区段间存在显著差别。GO（Gene Ontology）注释表明大部分附睾小体蛋白位于细胞外泌体中，并参与转运、氧化还原、代谢等生理过程，并证实了附睾小体蛋白可转运到精子，进而发挥相关作用；此外，通过GO 注释新发现附睾小体蛋白参与精子受精和与透明带结合相关的生理过程。巨噬细胞迁移抑制因子是附睾小体中的重要成分，它可通过调节精子鞭毛中的游离巯基而影响Zn流出，进而影响精子致密纤维，从而参与精子成熟过程。此外，附睾小体中的醛糖还原酶可抑制精子能量生成，使成熟的精子保持静止状态，然后在附睾尾部和输精管再通过山梨醇脱氢酶活性将山梨醇氧化为果糖，从而为精子通过女性生殖道提供所需的能量。另外，谷胱甘肽过氧化物酶5 也是附睾小体的一种蛋白成分，它可保护精子免受氧化应激，同时保持DNA 的完整性。

附睾小体对精子产生作用可能与其转运功能性调控物质到精子有关。有研究表明精子在通过附睾的过程中会摄取不同蛋白质尤其是GPI 锚定蛋白，以促进膜的完整性。人附睾蛋白CD52 是一个细胞表面高度糖基化的GPI 锚定小肽，被认为是负责转移附睾分泌蛋白至精子，而富含GPI 锚定蛋白的附睾小体在这其中发挥重要作用。P26h 和P25b 是一对等位基因，它们编码精子质膜上的2 种锚定蛋白。研究发现仓鼠精子在经过附睾时P26h 含量增加，而相应附睾小体相关的P26h 数量减少，这表明附睾小体可转运该蛋白到精子；同时，在牛附睾中发现P25b 参与附睾小体向精子转移蛋白的生理过程。附睾小体功能与其生成的部位也有关，每一段附睾生理作用不同，其细胞及细胞分泌物的生理功能也不相同。而且附睾小体-精子相互作用中存在相应的受体，如乳脂球EGF 因子8（Milk Fat Globule-EGF Factor 8，MFGE8），说明附睾小体可主动转运其内含物至精子，在牛上已证实附睾小体可将附睾分泌蛋白选择性转移到精子内。这些都说明附睾小体在精子成熟过程中发挥重要作用。在小鼠和牛上的研究还证实了大部分附睾小体的miRNA 可在精子中检测到，说明了二者间具有频繁的物质交流和相互作用，附睾小体可介导一些小RNA（small RNAs，sRNAs）如miRNA 的转移，这些sRNAs 都与精子成熟过程具有重要关系。除了miRNA 外，Sharma 等通过sRNA测序发现在附睾腔液中存在大量来源于转运RNA 的小片段（transfer RNA-derived RNA fragments，tRFs），其总量可占到sRNA 的80%，这些tRFs 可将遗传信息传递到下一代小鼠。总之，附睾小体与附睾中精子的成熟具有重要关系，大量研究表明附睾腔内的RNA、蛋白质、脂质可通过附睾小体转运到精子中，进而对精子成熟产生影响。

3.2 前列腺小体对精子功能的作用 雄性动物SP-EVs还有一部分是来源于前列腺的前列腺小体，它最早在人类精液中被发现。前列腺小体属于一种特殊的SPEVs，它具有很高的胆固醇/磷脂比例（接近2:1），其磷脂含量大部分为鞘磷脂，前列腺小体膜中的脂肪酸大多数是饱和脂肪酸（硬脂酸和棕榈酸）或单不饱和脂肪酸（油酸），这种结构有利于前列腺小体的稳定，同时有利于前列腺小体与其他细胞融合，并将其内容物转移到受体细胞。目前已有报道前列腺小体中含有二肽基肽酶IV 和氨基肽酶N，二者都可从前列腺小体转移到精子中，说明前列腺小体具备将其内容物转移到精子的能力，从而发挥调控功能。

为探索前列腺小体的生理功能，研究人员以输精管结扎者的精液中EVs 为研究对象，确保不含睾丸或附睾分泌物，鉴定前列腺小体的特征，发现在这些前列腺小体中都含有前列腺干细胞抗原，这是一种前列腺特异的蛋白质，说明鉴定到的囊泡来源于前列腺。而且这些前列腺小体可分为粒径为（56±13）nm 和（105±25）nm的2 个群体，它们在密度、大小和表面蛋白标记物CD9的存在等方面都与外泌体特征一致。前列腺小体含有高含量的胆固醇，它可与精子结合抑制胆固醇流出，有利于抑制射出的精子过早获能并维持精子顶体的完整性，从而延长精子在体外存活时间。精子进入雌性生殖道后需要穿过子宫颈和透明带以完成受精，这需要精子具备强有力的前进动力。而前列腺小体富含不同的蛋白质和二价阳离子，如钙、镁、锌离子等，前列腺小体可通过调节这些离子浓度变化促进精子活力，帮助精子受精。除此之外，精子与前列腺小体融合可诱导持续Ca信号反应，从而影响精子运动。研究者也发现在前列腺小体中富含与无氧酵解相关的酶，以及参与ATP 转换的腺苷酸激酶、ATP 酶、5-核苷酸酶和己糖转运蛋白，这些酶都与ATP 生成有关，说明前列腺小体通过调节能量代谢从而调节精子活力。再者，前列腺小体还可能通过与白细胞的直接相互作用、与补体系统的相互作用或抗菌及抗病毒机制调节雌性生殖道免疫反应，维持精子在雌性生殖道中的活力。另外，前列腺小体还能参与NADPH 氧化酶抑制嗜中性粒细胞中过氧化物产生从而发挥免疫调节作用。精子质膜因不饱和脂肪酸含量高，其本身体积小，细胞质含量少，容易受氧化应激的影响，而精液中产生的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）被认为是造成先天性不育的重要原因之一，研究发现添加前列腺小体可减少精液整体ROS 水平，说明精液中前列腺小体具备抗氧化作用。在精液常温保存和冷冻保存过程中会产生很多的ROS，这也意味着通过研究精液中SP-EVs相关作用机理可为提高精液常温保存和冷冻保存的效率提供新的途径。

研究前列腺小体的相关特征还可为前列腺癌早期诊断及转移提供有价值的信息。前列腺小体通常从柱状的前列腺上皮细胞顶端分泌到腺腔中，然后进入精液或尿液中，而恶性的前列腺上皮细胞变成长方体并失去极性，当这些细胞侵入正常组织后，它们分泌的前列腺小体可直接进入前列腺组织的空腔中，或直接分泌到血液循环中。通过对比正常和前列腺癌分泌的前列腺小体特征，找出其中的关键差异，就可为早期诊断提供便利。研究人员通过利用高效液相色谱结合串联质谱对人SPEVs 进行蛋白质组学分析，共发现1 474 个蛋白，GO富集分析发现它们与外泌体、细胞质和细胞液相关，它们主要参与细胞新成代谢、能量代谢、蛋白质代谢、细胞生长、维持和运动等生理过程。而且人精液中分离出的SP-EVs 还携带microRNA、Y RNAs、tRNAs 等，它们都具有潜在的调节功能。综上可知，SP-EVs 含有许多调控物质，它们对精子的调控作用是多种多样的。通过进一步挖掘精子发生及其受精过程的调控机制，可为精子的保存、精子相关疾病治疗等相关研究提供更多翔实的资料。

3.3 目前SP-EVs 研究中存在的不足及挑战 精浆由雄性生殖道分泌物组成，其来源构成一般为睾丸2%～5%，附睾和前列腺20%～30%，精囊腺65%～75%，尿道球腺1%。目前文献报道的SP-EVs 以附睾小体和前列腺小体为主，针对精囊腺来源的EVs 研究较少。实际上精囊腺也分泌EVs，且精囊腺EVs 的蛋白质组成不同于附睾小体和前列腺小体，说明精囊腺EVs 可能是一类不同于附睾小体和前列腺小体的SP-EVs。精囊腺EVs 的功能是否与附睾小体和前列腺小体相似，是否是精浆功能的主要影响因素，仍需要继续进行研究。

针对性的研究来自某一部位EVs 也有很多挑战，一方面取样比较困难，如手术或者解剖动物的成本较高，另一方面也无法保证取到的样品不含有其他部位液体的污染。因此直接把人或者动物射出的精液中SP-EVs 作为一个整体研究值得探索，直接分离出SP-EVs，并鉴定出其中的关键分子作为影响精子功能调控物质或雄性生殖相关疾病诊断的判断依据，具有很高的应用价值。

此外，研究EVs 需要合适的分离和浓缩方法，不同分离方法对提取到的EVs 类型和细胞等污染物残留有不同影响，从而对后续研究造成影响。目前分离EVs的常用方法包括超速离心、沉淀法、超滤法，基于尺寸排除和亲和吸附的色谱法以及免疫亲和捕获法等。不同样品适用不同的方法。SP-EVs 来源广泛，成分复杂，要将其作为一个整体研究，必须要摸索出最适宜的分离方法，减少分离到的SP-EVs 异质性和杂质污染，同时，在得到EVs 后应根据公认的标准对其进行鉴定，只有满足这些条件的EVs 才可以继续进行下一步分析。

4 展 望

通过分析精浆对精子生理功能的重要作用以及阐明SP-EVs 作为一种潜在的有效调控物质，有利于深入挖掘SP-EVs 的功能及其作用机制，拓展关于精子调控机制的认识。而且，深入理解精浆对精子功能的影响机制，可以为人类某些不孕不育疾病发病原因、诊治以及目前辅助生殖技术提供有价值的参考信息，还可为畜牧生产中寻找高繁殖力公畜，提高公畜精液质量及母畜繁殖力提供新的思路，同时也为精液的常温及冷冻保存、人工输精等生产过程提供参考。