β-烟酰胺单核苷酸跨境产品中NMN含量的测定

张文宇，兰 韬 ，赵 溪，吴 琦，初 侨，于聪聪，王大宏，张维冰，云振宇

（1.齐齐哈尔大学，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.中国标准化研究院，北京 100191；3.汤臣倍健股份有限公司，广东珠海 519040；4.庶正康讯（北京）商务咨询有限公司，北京 100054；5.华东理工大学，上海 200237）

β-烟酰胺单核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide，NMN）是一种具有生物活性的核苷酸，由磷酸基和含核苷的核糖与烟酰胺反应自然形成[1]，分子结构如图1所示。在动物细胞中，NMN是一种细胞能量来源，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）生物合成的代谢物，在细胞增殖和功能中起着至关重要的作用[2]。研究表明补充NMN可以提高体内NAD+含量[3]，从而延缓、改善、防止衰老诱导的代谢紊乱、老年疾病等[4−9]，所以NMN近年来成为生理医学领域的研究热点，并成为医药、功能性食品、化妆品等行业的珍贵原料[10−11]。由于NMN在我国还未获得药品、保健食品、食品添加剂和新食品原料许可，所以主要作为跨境产品通过跨境电商平台进入国内。

图 1 β-烟酰胺核苷酸的分子结构式Fig.1 Molecular structure formula of β-nicotinamide nucleotide

人体可自身合成少量NMN[12]，也会通过摄食西兰花、卷心菜等果蔬补充NMN[13]。但由于这些果蔬中NMN含量都较少，如果想通过食物来补充NMN非常困难。所以近年来以NMN为主要活性物质的膳食补充剂成为消费市场的宠儿，但是诸多乱象也如影随形，其中最严重的就是部分NMN产品根本不含有NMN或者NMN含量远少于其标称，达到以次充好的目的。目前国内可以在跨境电商平台上购买到NMN跨境产品，但这类产品售价普遍十分高昂，最便宜的也要1500元/瓶，贵的甚至有20000元/瓶[14]，如果没有做好产品质量控制，将严重损害消费者权益。所以2021年2月国家市场监管总局食品经营司下发《关于排查违法经营“不老药”的函》（以下简称“排查函”），明确指出目前NMN在我国未获得药品、保健食品、食品添加剂和新食品原料许可，不能作为食品进行生产和经营，要求各个省级市场监管部门对相关经营者进行全面排查。

目前国际上还没有NMN跨境产品中NMN含量测定方法标准，无法对此类产品中NMN含量进行准确测定，就无法对相关食品进行监管。所以非常有必要研制NMN跨境产品中NMN含量的检测方法标准，可以有效解决NMN行业中以次充好问题，实现净化市场的目的，并满足监管需求。我国是NMN原料的主要生产国之一，开发相关标准方法对于促进我国NMN的综合利用具有重要意义。

NMN具有极性大、不易挥发、分子内成盐、易溶于水、难溶于有机溶剂的性质[15−18]，前人研究[19]认为，该性质制约了很多常规定量分析方法的应用。常见的定量检测方法包括液相色谱-紫外法（HPLCUV）[20]、液相色谱-质谱法（HPLC-MS）[21]、毛细管电泳法（CE）[22]、核磁共振波谱法（NMR）[23]。由于在NMN产品中NMN含量较高，通常都在10%以上，HPLC-MS、NMR方法灵敏度高、仪器昂贵，造成检测成本较高，而CE法装机量较少，应用还不够普遍。而HPLC-UV法以其操作简单、普适性好、应用广泛而成为NMN检测的利器。目前对NMN的定量检测主要集中于细胞提取物[24]、果蔬等基质[25]，缺乏胶囊、片剂等剂型基质中NMN含量检测方法研究。有鉴于此，本文将通过优化样品的前处理方法和液相色谱方法，开发胶囊、片剂等剂型NMN跨境产品中NMN含量开发相应的检测方法，并通过方法学验证，为建立相应的检测方法标准奠定方法学基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

NMN标准品：β-烟酰胺单核苷酸（C11H15N2O8P）（CAS 1094-61-7，纯度≥98%） 上海源叶生物科技有限公司；甲醇（CH4O） 色谱纯，德国Merck公司；甲酸（CH2O2） 色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；6种市售NMN胶囊、NMN片剂产品（其中4种为片剂、2种为胶囊剂） 采购于天猫。

iChrom5100分析型国产液相色谱仪，配DAD检测器 大连依利特分析仪器有限公司；Venusil HILIC色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，100 Å） 天津博纳艾杰尔科技有限公司；Thmorgan-VM200型涡旋振荡器 托摩根生物科技有限公司；HITACHICF15RXII离心机 日立公司；Sartorius分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；ELGA纯水仪 北京诚驿恒仪科技有限公司；LMDTC-15F超声波清洗仪 北京绿棉科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制

1.2.1.1 标准储备液 准确称取10 mg NMN（精确到0.01 mg）标准品置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至10 mL，配成浓度为1000 μg/mL标准储备液，避光保存于4 ℃冰箱备用，有效期3个月。

1.2.1.2 标准工作溶液 以50%甲醇水溶液为溶剂，将NMN标准储备液稀释至500、250、100、50、25、10、5 μg/mL的系列标准工作液，此溶液需现用现配。

1.2.2 样品前处理 取去除胶囊的粉末状样品100 g于石英研钵中，研磨至碎，过0.18 mm筛备用。

准确称取已研细的去除胶囊的粉末状样品0.5 g（精确到0.001 g）于50 mL容量瓶中，加入25 mL 50%甲醇水溶解，超声20 min使其充分溶解，提取两次，合并提取液，以10000 r/min的速度离心5 min，取上清液经0.22 μm有机滤膜过滤，取250 μL样品溶液用50%甲醇水定容至10 mL后进样检测。

片剂样品前处理方法同上。

1.2.3 液相色谱条件 液相色谱柱为Venusil HILIC（4.6 mm×250 mm，5 μm，100 Å），进样体积为10 μL，流速1 mL/min，柱温：35 ℃，检测波长为235 nm，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸甲醇溶液，采用等度洗脱，流动相A:流动相B=15:85（V/V）。

1.2.4 标准曲线的绘制 将配制好的5、10、25 、50 、100、250、500 μg/mL标准工作溶液按“1.2.3”的液相色谱条件进样分析，以NMN的浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标，绘制系列标准曲线，进行线性回归，得到NMN的标准曲线线性回归方程。

1.2.5 精密度试验 在相同仪器条件下，取90 μg/mL浓度的标准工作溶液，按“1.2.3”色谱条件重复进样6次，测得各被检测组分的峰面积，代入标准曲线线性回归方程得出测定浓度值，再计算测定浓度的相对标准偏差RSD。

1.2.6 稳定性试验 在相同仪器条件下，精密称取0.5 g（精确到0.001g）已粉碎的片剂样品以及胶囊样品以“1.2.2”的前处理方法，制成两种基质的提取液，在同一天内，以“1.2.3”色谱条件进样分析，每2 h测定一次，总共测定6次，测得被检测组分的峰面积，代入标准曲线线性回归方程得出测定浓度值，再计算测定浓度的相对标准偏差RSD。

1.2.7 重复性试验 在相同的仪器条件下，精密称取0.5 g（精确到0.001 g）已粉碎的片剂和胶囊样品6份，按“1.2.2”前处理方法方法操作，将处理好的待测液按“1.2.3”色谱条件进样分析，测得样品中NMN的峰面积，代入标准曲线方程，计算测定浓度的标准偏差RSD。

1.2.8 定量限、检出限的测定 将“1.2.1.2”的标准工作溶液按“1.2.3”的液相色谱条件测定，测得NMN的峰面积，代入相应物质的标准曲线回归方程中。以最低水平标准溶液中目标组分的3倍平均信噪比为检出限（LOD），10倍平均信噪比为定量限（LOQ），计算得本方法的LOD和LOQ。

1.2.9 加标回收率试验 准确称取0.5 g（精确到0.001 g）已粉碎的片剂样品、胶囊样品各12份，编号1～12，其中1～3号作为本底（基质样品），加入一定量标准储备液，4～6号为加标量为5 μg/mL的待测液，7～9号为加标量为10 μg/mL的待测液，10～12号为加标量为50 μg/mL的待测液，按照“1.2.2”操作，将处理好的待测液以及低、中、高3种浓度的加标样品经HPLC分析，测得峰面积，计算回收率。

1.3 数据处理

本文标准曲线线性回归方程及相关系数由依利特iChrom5100 workstation处理所得，其他数据采用Origin 6.0和Excel 2010软件对数据进行处理并作图，实验数据取3次平行实验的平均值。

2 结果与分析

2.1 液相色谱条件优化

经查阅文献[26−27]，研究者们通常采用反相C18色谱柱来实现NMN的分离，但由于NMN的极性较大，几乎没有保留，出峰时间过早，容易与样品基质峰发生混淆。所以本文考虑使用对于极性样品分离效果较好的HILIC色谱柱[28−29]进行样品的分离。

为尽可能地将待测的NMN与胶囊和片剂样品基质中其他成分分离开，首先对流动相溶液配比进行了优化。用50%甲醇水溶液作为提取液溶解胶囊和片剂样品配制成待测液，分别以95% B、85% B、50% B（V/V）的等度分离方式对NMN胶囊和片剂样品进行色谱分离，通过单标法对峰的归属进行了确证，由此判断检测时最佳的流动相比例。分离谱图如图2所示，其中图2a为NMN片剂样品的分离谱图，图2b为NMN胶囊的样品分离谱图。从图中可以看出，随着流动相中甲醇含量的增大，NMN的出峰时间逐渐后移。对于片剂样品以50%比例等度洗脱时，NMN与基质无法得到有效分离，而使用95% B比例等度洗脱时NMN的出峰时间较晚，影响分析方法的效率，而且也伴随着峰展宽。当使用85% B比例等度洗脱时分离效果最好，NMN的出峰时间较短，峰形也基本满足高斯分布，可以达到基质中杂质峰与被分析物色谱峰分离的效果，降低了杂质峰干扰的可能，从而省去对提取液进行净化处理的步骤，可以将分析方法的总体时间控制在8 min内完成，使得操作简便、耗时较短，提高了分析检测效率。对于基质较为简单的胶囊样品，可以看出同样使用85% B比例等度洗脱，具有最好的分离效果、峰形和分析效率。所以采用85% B比例等度洗脱进行后续实验。

图2 NMN片剂样品基质（a）和NMN胶囊样品基质（b）的流动相优化分离色谱图Fig.2 Chromatograms of NMN tablet sample matrix (a) and NMN capsule sample matrix (b) based on mobile phase optimization

对于可离子化的样品，甲酸具有改善峰形的作用[30]。因此，本文对流动相中甲酸的加入进行优化对比，在85%比例等度洗脱条件下，考察了0.1%甲酸加入前后NMN片剂和NMN胶囊剂样品基质中各被测组分分离效果，结果如图3所示。结果表明，不加甲酸，NMN的峰拖尾现象明显，而且出峰时间明显推迟了8 min。而加入甲酸使各被测组分的峰形得到了良好的改善，并将整个分析时间控制在8 min内，极大地提高了分析效率。这可能是由于甲酸的加入抑制了NMN的解离，降低了其在HILIC色谱填料上的保留，缩短了出峰时间。所以在流动相中加入甲酸进行后续实验。

图 3 甲酸加入前后NMN片剂（a）NMN胶囊剂（b）样品基质分离谱图Fig.3 Chromatograms of NMN tablets matrix (a) and NMN capsule sample matrix (b) before and after formic acid addition

综上，对于NMN片剂和NMN胶囊基质，采用添加甲酸的方式能够改善NMN峰形，因此以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇溶液（15:85，V/V）为流动相进行分离。

2.2 提取溶剂优化

根据NMN的理化性质[10−12]，NMN在水中溶解度较大，在甲醇中溶解度较小，在仪器及实验条件相同情况下，本实验选择了水溶液、50%甲醇水溶液、85%甲醇水溶液3种溶剂开展样品提取溶剂优化实验。由于NMN在甲醇中几乎不溶，故不选择用纯甲醇作为提取溶剂。取0.5 g粉碎后的片剂和胶囊样品，向其中各添加一定量的NMN标准储备液，使加标浓度为10 μg/mL，采用“1.2.2”的样品提取方式，分别以上述3种溶剂进行提取，并测定加标回收率，结果如下表1所示。从表1中可以看出，以50%甲醇水溶液作为提取溶剂，样品的回收率可控制在90%～110%之间，同时偏差最小，具有最佳的提取效果。因此，在后续实验中采用50%甲醇水提取溶剂进行提取。

2.3 标准曲线、检出限、定量限

以“1.2.3”中的色谱分析条件对NMN标准工作溶液进行测定，通过iChrom5100 workstation绘制标准曲线回归方程，其线性范围、相关系数、LOD及LOQ如表2所示。

由表2数据可知，本方法在5～500 μg/mL范围内有较好的线性关系，相关系数r为0.999。经计算，NMN的检出限（LOD，S/N=3）为1.0 mg/kg，定量限（LOQ，S/N=10）为3.0 mg/kg。

2.4 仪器精密度实验

按照“1.2.5”中实验步骤，对浓度为90 μg/mL的NMN标准溶液进行6次平行测定，将测得的NMN的响应值带入线性方程计算得到溶液中NMN的含量，并计算6次测定结果的RSD如表3所示。

由表3数据可知，仪器精密度实验结果的RSD为0.3%，表明本文发展的液相色谱方法具有较好的重现性，方法精密度较好，可以用于后续实际样品中N MN含量的测定。

2.5 稳定性实验

以“1.2.6”中实验步骤进行操作，考察方法的稳定性，经过6次平行实验，测得片剂和胶囊样品中NMN的浓度与RSD如表4所示。

由表4数据可知，对于NMN片剂和NMN胶囊，6次测定结果RSD均较小，说明结果都保持高度一致，可以保证方法的稳定性。

2.6 重复性实验

按照“1.2.7”中的实验步骤，将测得的NMN片剂、胶囊原液的6组平行样品中NMN的浓度及RSD计算汇总，结果如下表所示。

由表5数据可知，两种样品重复性实验的RSD在0.6%～1.8%之间，表明本方法重复性较好，表明本文开发的前处理方法结合HPLC方法可以用于NMN片剂和NMN胶囊中的NMN含量测定，并能使结果具有良好的重复性。

2.7 加标回收率实验

按“1.2.9”中步骤进行操作，对制备的5、10、50 mg/kg的低、中、高三种加标水平的NMN片剂和NMN胶囊剂样品中NMN含量进行了测定，并计算回收率和RSD%，结果如表6所示。

由表6数据可知，NMN片剂和NMN胶囊样品中NMN的检测回收率在90.9%～108.9%之间，相对标准偏差均不超过1.9%，表明本方法回收率好，结果准确可靠，本方法可用于实际样品中NMN含量的准确测定。

2.8 实际样品测定

按照本文发展的NMN片剂和NMN胶囊剂样品基质中NMN含量的检测方法对市售6个品牌的NMN产品中的NMN含量进行分析测试，检测结果见表7。

实际样品分析结果表明，所有样品中都检出了NMN，但是部分产品的实际含量较其标称含量偏少，如2号样品中NMN含量只有其标称值的一半，3号样品中NMN含量只有其标称值的三分之一，涉及虚假宣称。

表 1 不同溶剂对NMN提取效率的影响（n=3）Table 1 Effects of different solvents on the extraction efficiency of NMN (n=3)

表 2 NMN的线性范围、LOD和LOQTable 2 Standard curve, linear range, LOD and LOQ of NMN

表 3 精密度实验结果（μg/mL）Table 3 Precision test results (μg/mL)

表 4 稳定性实验结果（mg/kg）Table 4 Results of stability experiments (mg/kg)

表 5 重复性实验结果（mg/kg）Table 5 Results of repeatability experiment (mg/kg)

表 6 加标回收率实验结果Table 6 Experimental results of standard recovery

表 7 6种不同NMN产品中NMN含量（g/kg，n=3）Table 7 NMN content in 6 different NMN products(g/kg, n=3)

3 结论

本文建立了一种NMN胶囊和NMN片剂基质中NMN含量的检测方法，方法通过调节色谱分离条件，使目标组分与基质成分完全分离，无需进行样品净化操作，同时控制流动相组成，整个分析时间控制在8 min内，具有操作简便、检测效率高、准确性好等优点。该方法为制定NMN跨境产品中NMN含量的检测方法标准奠定了方法学基础，对于提高NMN相关产品质量，促进相关产业的便捷监管具有深远意义。