miR-222-3p在肺炎支原体感染小鼠免疫机制中的作用

张芳琼 王嘉怡 杨萍

(1湖北省秭归县人民医院医学检验科，湖北 宜昌 443600；2湘南学院医学影像与检验学院；3江汉大学附属医院(武汉市第六医院)心血管内科)

肺炎支原体肺炎是由肺炎支原体引起的炎性疾病，儿童发病率最高，肺炎支原体可影响机体免疫系统，促进多种炎症因子释放，影响机体免疫功能〔1〕。肺炎支原体肺炎发病机制复杂，受到miRNA、信号通路等的影响〔2〕。miR-222-3p是一个多功能影响因子，与炎症等进展有关〔3〕。miR-222-3p在肺炎支原体肺炎患者中高表达，且miR-222-3p可能通过下调CD4+水平影响机体免疫反应〔4〕。本实验旨在探讨miR-222-3p在肺炎支原体肺炎小鼠免疫机制中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级BALB/c小鼠，4～6 w，体重18～22 g，由三峡大学提供，动物许可证号：SCXK(鄂)2017-0012。药品与试剂：miRcute增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司生产，货号：KR211)、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司生产，货号：FP411)；miR-222-3p agomir阴性对照、miR-222-3p agomir、miR-222-3p antagomir阴性对照、miR-222-3p antagomir由上海吉玛制药技术有限公司构建提供；肺炎支原体标准菌株购自上海佰泰科技有限公司；白细胞介素(IL)-1β测定试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，货号：SEKR-0002；IL-6测定试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司，货号：ZC-37988；干扰素(IFN)-γ测定试剂盒购于上海恪敏生物科技有限公司，货号E-EL-R0578；IL-10测定试剂盒购于上海研谨生物科技有限公司，货号：F11829-1；免疫球蛋白(Ig)G测定试剂盒由上海将来实业股份有限公司生产；IgM测定试剂盒由北京贝尔生物工程有限公司生产；大鼠抗CD4-FITC抗体购于上海江莱生物科技有限公司，货号：ANT-292；大鼠抗CD8-PE抗体购于艾美捷科技有限公司，货号：8120-09。仪器：PT-350C酶标仪，北京普天新桥技术有限公司产品；7500荧光定量PCR仪，美国ABI公司产品；Qi3536血细胞计数器，长沙巴跃仪器有限公司产品。

1.2模型建立〔5〕小鼠饲养温度20～25℃，湿度在50%左右，不限制饮水。各组小鼠在适应性饲养3 d后，用水合氯醛麻醉，滴鼻接种肺炎支原体菌液100 μl(1×107CCU/ml)，连续滴鼻接种3 d，接种后保持小鼠头部向后倾斜45°约1 min。观察小鼠精神状态欠佳，饮食量下降，鼻腔分泌物增多，挠鼻，则初步判定造模成功。

1.3动物分组与给药方法 60只造模成功的小鼠随机分成模型组、miR-NC组、miR-222-3p组、Anti-miR-NC组、Anti-miR-222-3p组，每组12只，另外随机选取12只小鼠作为对照组，小鼠滴鼻等量生理盐水。miR-NC组、miR-222-3p组、Anti-miR-NC组、Anti-miR-222-3p组造模后第2天，分别尾静脉注射20 μg(溶解于2.5 ml生理盐水)〔6〕miR-222-3p agomir阴性对照、miR-222-3p agomir、miR-222-3p antagomir阴性对照、miR-222-3p antagomir，对照组和模型组给予等剂量生理盐水尾静脉注射。连续注射5 d。最后1次注射后次日，摘取眼球，采集血液，一部分血液分离血清组织，用于血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IgG、IgM检测，一部分抗凝处理，用于检测T淋巴细胞亚群。水合氯醛麻醉小鼠，切开胸部皮肤，分离气管，结扎右肺，插入一次性输液管，注入生理盐水2.5 ml，灌洗肺泡，收集肺泡灌洗液，用于炎性细胞计数。取左肺，用于肺组织病理学评分和miR-222-3p表达检测。

1.4Realtime PCR方法检测miR-222-3p表达〔7〕取肺组织，用Trizol试剂提取总RNA，以miRcute增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂盒、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒进行Realtime PCR，内参为U6。引物为U6上游(5＇-3＇)-CAGCACATACTAAAATTGGAACG，下游(5＇-3＇)-ACGAA-TTTGCGTGTCATCC，上游(5＇-3＇)-GAAAGTTCGTCCAGCTACATCTG，miR-222-3p下游(5＇-3＇)-TATGGTTGTTCTCGTCTCTGTGTC。

1.5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IgG、IgM〔8〕收集血清，根据IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IgG、IgM测定试剂盒检测血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IgG、IgM含量，步骤同试剂盒标准流程。

1.6流式细胞术检测T淋巴细胞亚群〔9〕收集100 μl抗凝血，离心后吸取上清，添加10 μl CD4-FITC、CD8-PE抗体，混合后，在室温避光条件下结合30 min，添加500 μl红细胞裂解液，混匀后，室温孵育30 min。3 000 r/min离心5 min。弃掉上清，继续加入500 μl缓冲液，室温结合15 min。用流式细胞仪检测。

1.7血细胞计数器计数炎性细胞〔10〕肺泡灌洗液以300 r/min离心10 min，取沉淀，用生理盐水悬浮并定容到200 μl。血细胞计数仪计数炎性细胞总数。

1.8苏木素-伊红(HE)染色评价肺组织病理学变化〔5〕肺组织放在4%多聚甲醛中固定，蒸馏水洗涤，以不同浓度的乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡切片，放在60℃烘箱中孵育30 min。用二甲苯及浓度梯度乙醇将肺组织中的石蜡脱去。切片放在苏木素中染色10 min，蒸馏水洗涤，伊红染色5 min。二甲苯透明，中性胶封片。在显微镜下对肺组织病理学进行评分，评分从细支气管/支气管浸润、定性、管腔渗出、血管周围浸润、实质性肺炎5个方面进行评价，评价标准参照文献〔11〕。

1.9统计学处理 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组miR-222-3p表达比较 对照组、模型组、miR-NC组、miR-222-3p组、Anti-miR-NC组、Anti-miR-222-3p组肺组织中miR-222-3p表达量分别为1.00±0.12、1.53±0.25、1.61±0.11、3.21±0.34、1.63±0.12、0.85±0.08，模型组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)；miR-222-3p组与miR-NC组差异有统计学意义(P<0.05)；Anti-miR-222-3p组与Anti-miR-NC组差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2各组血清中炎症因子比较 模型组血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10含量与对照组差异有统计学意义(P<0.05)；miR-222-3p组与miR-NC组差异有统计学意义(P<0.05)；Anti-miR-222-3p组与Anti-miR-NC组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10含量比较

2.3各组血清中IgG、IgM比较 对照组、模型组、miR-NC组、miR-222-3p组、Anti-miR-NC组、Anti-miR-222-3p组血清中IgG含量为(1.77±0.17)mg/ml、(2.90±0.27)mg/ml、(2.91±0.26)mg/ml、(3.25±0.21)mg/ml、(2.86±0.29)mg/ml、(2.38±0.40)mg/ml，IgM含量为(0.53±0.06)mg/ml、(0.96±0.08)mg/ml、(0.92±0.15)mg/ml、(1.29±0.13)mg/ml、(0.94±0.10)mg/ml、(0.73±0.05)mg/ml，模型组血清中IgG、IgM含量与对照组差异有统计学意义(P<0.05)；miR-222-3p组与miR-NC组差异有统计学意义(P<0.05)；Anti-miR-222-3p组与Anti-miR-NC组差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4各组T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+水平比较 对照组、模型组、miR-NC组、miR-222-3p组、Anti-miR-NC组、Anti-miR-222-3p组T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+水平为3.86±0.16、1.63±0.15、1.64±0.12、1.37±0.08、1.59±0.14、2.55±0.33，模型组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)；miR-222-3p组与miR-NC组差异有统计学意义(P<0.05)；Anti-miR-222-3p组与Anti-miR-NC组差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.5各组肺组织病理学评分和肺泡灌洗液中炎性细胞数目比较 模型组肺组织病理学评分和肺泡灌洗液中炎性细胞数目与对照组差异有统计学意义(P<0.05)；miR-222-3p组与miR-NC组差异有统计学意义(P<0.05)；Anti-miR-222-3p组与Anti-miR-NC组差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组肺组织病理学评分和肺泡灌洗液中炎性细胞数目比较

3 讨 论

肺炎支原体感染可影响机体免疫功能。辅助型T细胞亚型Th1/Th2比值失衡是诱导炎症损伤发生的关键因子，Th1/Th2比值失衡促进IFN-γ释放，而IFN-γ可诱导巨噬细胞活化，抑制IL-10等免疫抑制因子表达，促进炎症因子IL-1β、IL-6表达，加强炎症反应〔2,11〕。T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+可间接反映机体免疫功能，因此检测CD4+/CD8+比值可反映机体免疫水平〔12〕。IgG、IgM属于免疫球蛋白，其水平高低与机体免疫功能有关〔13〕。本实验显示，肺炎支原体感染后的小鼠血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ含量升高，IgG、IgM含量升高，且IL-10含量降低，且CD4+/CD8+比值降低，肺组织病理学评分和肺泡灌洗液中炎性细胞数目增加，说明成功构建了肺炎支原体肺炎小鼠模型。

肺炎支原体肺炎分子发生机制复杂，与miRNA等表达有关〔3〕。miR-222-3p是与肿瘤〔14〕、免疫炎症反应〔3〕等有关的调控因子。报道显示〔4,15〕，miR-222-3p在肺炎支原体肺炎中高表达，且下调miR-222-3p可抑制肺炎支原体诱导的巨噬细胞炎症，miR-222-3p可能是肺炎支原体肺炎的促进因子。本实验表明，过表达miR-222-3p可进一步提高血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ、IgG、IgM含量，降低IL-10含量，降低CD4+/CD8+比值，提高肺组织病理学评分和肺泡灌洗液中炎性细胞数目，而抑制miR-222-3p发挥相反的作用，说明miR-222-3p在肺炎支原体感染小鼠免疫机制中发挥促进作用，为进一步研究肺炎支原体肺炎分子发生机制奠定了基础。