不同气候带森林土壤微生物多样性和群落构建特征*

丛 微 于晶晶 喻海茫 丁 易 张于光

(1.中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所 国家林业和草原局生物多样性保护重点实验室 北京 100091； 2.湖南省长沙县职业中专学校 长沙 410142)

土壤微生物作为分解者可将地上植物群落和生态系统养分循环紧密地联系起来，显著影响生态系统功能。较高的微生物多样性能够增强养分交换和资源互补利用，改善植物获取养分的能力和提高生产力(Tedersooetal.， 2020)。此外，土壤微生物在影响温室气体排放以及改善土壤污染等方面也具有重要作用(Sutkaetal., 2003； Xuetal.， 2015)。土壤生物多样性的减少或丧失、群落组成的简化明显削弱了生态系统功能，例如在植物多样性、养分利用、养分循环和物质降解等方面(Waggetal.， 2014)。

随着分子生物学发展和进步，研究者对土壤微生物多样性分布规律从局域水平、区域水平以及全球尺度等不同空间尺度进行研究。目前，对影响土壤微生物群落空间分布模式的关键因素仍存在较大争论，环境因子(如土壤pH值、植被类型)是影响微生物空间分布的主要因素(Shietal.， 2018； Tedersooetal.， 2014)，而在区域尺度下，历史进化因素决定了土壤微生物多样性(Geetal.， 2008)。此外，Hanson等(2012)提出了土壤微生物的分布由选择、漂变、扩散和突变以及它们相互作用共同决定。因此，土壤微生物群落空间分布的差异，可能是由研究尺度或微生物群落所处环境及历史进化因素不同所导致。

深入认识森林土壤微生物多样性及其对环境变化的响应，可为森林生态系统管理提供科学依据。本研究以4种不同气候带的森林土壤细菌和真菌为对象，即温带针叶林、暖温带针阔混交林、亚热带常绿落叶阔叶混交林、热带雨林，在较大空间尺度分析森林土壤微生物多样性和群落构建特征。主要探讨的问题包括： 1)不同气候带森林土壤细菌和真菌群落的组成及其分布模式； 2)森林土壤细菌和真菌的群落构建特征和异同； 3)影响不同气候带森林微生物群落结构的主要环境因子。

1 材料与方法

1.1 样地设置与土壤样品采集

选择温带针叶林(新疆喀纳斯国家级自然保护区、新疆库尔德宁西天山保护区，以下简称KNS、KEDN)、暖温带针阔混交林(甘肃小陇山林区，以下简称GS)、亚热带常绿落叶阔叶混交林(湖北木林子保护区，以下简称HB)和热带雨林(海南霸王岭保护区，以下简称HN)4种气候带森林为研究对象。KNS主要树种为西伯利亚红松(Pinussibirica)、西伯利亚云杉(Piceaobovata)和西伯利亚落叶松(Larixsibirica)； KEDN主要树种为天山云杉(Piceaschrenkianavar.tianschanica)； GS主要树种为锐齿槲栎(Quercusalienavar.acuteserrata)、白桦(Betulaplatyphylla)和小叶乌药(Linderaaggregatevar.playfairii)； HB主要树种为翅柃(Euryaalata)、多脉青冈(Cyclobalanopsismultinervis)、川陕鹅耳枥(Carpinusfargesiana)和小叶青冈(Cyclobalanopsismyrsinaefolia)； HN主要树种为陆均松(Dacrydiumpierrei)、刺栲(Castanopsishystrix)和五列木(Pentaphylaxeuryoides)(表1)。

在已建立的固定样地(每个6 hm2)采集土壤样品，按十字形布点方式在每个样地内随机选择17个20 m×20 m样方，在距离树干1 m以上的区域用土钻(直径3 cm)取样，每个样方内钻取16钻0～20 cm土壤并混合，过2 mm孔筛除去凋落物和碎石等。土壤样品分成2部分放入标记好的自封袋中，一部分保存在4 ℃冰箱中，用于土壤养分和理化性质分析； 一部分保存在-20 ℃冰箱中，用于土壤DNA测定分析。

1.2 土壤理化性质测定和植物调查

测定土壤理化性质，包括土壤含水量、pH值、有机质、全氮、全磷、全钾、水解性氮、有效磷、速效钾、铵态氮和硝态氮含量(鲍士旦， 2000)。

在每个样方内调查胸径≥1 cm的木本植物，记录其胸径、树高、坐标、种名等，并计算植物物种丰富度、Shannon-Wiener多样性指数、功能离散度和胸高断面积(路兴慧等， 2015)。

1.3 土壤微生物DNA提取及测序

通过PowerSoil试剂盒(QIAGEN，德国)提取土样总DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，NanoDrop2000检测提取的DNA溶液浓度和纯度。使用16S rRNA基因引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增细菌V3-V4区(Morietal.， 2014)。使用真菌ITS引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和TIS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)对真菌ITS1区扩增(Adamsetal.， 2013)。使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司，美国)回收PCR产物，并用Tris_HCl洗脱和2%琼脂糖电泳检测PCR产物。通过MiSeq PE300平台进行测序(美吉生物医药科技有限公司，上海)。

测序得到的双端序列数据利用Trimmomatic、FLASH软件进行拼接以及质控过滤(Bolgeretal.， 2014； Magoetal.， 2011)。非重复序列(不含单序列)利用Usearch软件进行OTU聚类，去除嵌合体得到OTU代表序列，并按照97%的序列相似性进行划分(Edgar， 2013)； 基于RDP classifier贝叶斯算法，在各分类水平上统计每个样地的群落组成(Wangetal.， 2007)。

1.4 数据分析

土壤微生物α-多样性由香农指数和丰富度指数表征，基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度(non-metric multidimensional scaling, NMDS)方法分析微生物群落组成的异质性。典范对应分析(cannoical correspondence analysis, CCA)和Mantel test方法分析影响土壤微生物群落结构的主要环境因子，其中CCA分析选择VIF值<20的环境因子。基于零模型方法分析微生物群落结构的构建过程(Zhouetal.， 2017)。数据分析基于R Studio(v.3.4.3)中的vegan包或Galaxy-DengLab分析平台(http:∥mem.rcees.ac.cn:8080)。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

不同气候带森林土壤理化性质见表1。各地点的土壤含水量均在20%以上，且呈酸性或弱酸性。KEDN样地具有较高的土壤有机质、全氮、全磷和水解性氮，这表明暖温带针叶林KEDN的土壤养分较高。植物香农指数在不同气候带差异显著(P<0.05)，主要表现为植物多样性在热带雨林中最高，其次是暖温带针阔混交林，暖温带针叶林中最低。HN和KEDN样地胸高断面积显著高于其他样地(P<0.05)，这表明其具有较高生物量。

表1 研究样地的土壤性质和植物多样性及其功能性状①

2.2 土壤微生物的物种组成

基于Illumina测序结果，共得到9 081个细菌物种OTU，属于30个门和502个属。在门水平(图1a)，变形菌门(Proteobacteria)占33.54%、酸杆菌门(Acidobacteria)占27.55%、放线菌门(Actinobacteria)占17.11%、绿弯菌门(Chloroflexi)占3.19%，共占群落组成的81.39%。在5个研究地点中，变形菌门和酸杆菌门在HN样地中的相对丰度最高，各占HN群落组成的40.23%和33.51%。在属水平(图1b)，共有14个属相对丰度>1%，其中慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)占6.76%，在KNS样地相对丰度最高；Gp6是KEDN和GS样地优势属，分别占11.24%、10.84%；Gp2是HB与HN样地的优势属，分别占10.13%、10.00%。

土壤真菌共得到16 107个OTU，主要归属为5个门类(图2a)，分别为担子菌门(Basidiomycota)占48.51%、子囊菌门(Ascomycota)占40.66%、接合菌门(Zygomycota)占8.33%、壶菌门(Chytridiomycota)占0.17%、球囊菌门(Glomeromycota)占0.16%，共占群落组成的97.84%。不同气候带的森林土壤其优势真菌不同，温带针叶林的优势菌是子囊菌门(KNS占55.66%； KEDN占53.82%)，暖温带针阔混交林(GS占53.88%)、亚热带常绿落叶阔叶混交林(HB占67.02%)、热带雨林(HN占57.69%)的优势菌是担子菌门。在属水平，共得到785个属，除去未分类的属后共有12个属相对丰度>1%(图2b)，其中Archaeorhizomyces属是KNS样地的优势属(22.60%)，被孢霉属(Mortierella)是KEDN样地的优势属(16.93%)，丝膜菌属(Cortinarius)是GS的优势属(11.20%)，红菇属(Russula)分别是HB(29.19%)和HN(13.79%)的优势属。

图1 不同气候带森林土壤细菌主要门(a)和属的相对丰度(b)

图2 不同气候带森林土壤真菌主要门(a)和属(b)的相对丰度

2.3 土壤微生物多样性

香农指数和丰富度指数用来表征土壤微生物群落的α-多样性，结果表明，各样地细菌香农指数具有显著差异(P<0.05)，而KNS和HN样地的丰富度指数无显著差异，但香农指数和丰富度指数在暖温带针阔混交林(GS)样地最高，在温带针叶林和热带雨林样地最低，细菌多样性在沿气候梯度的5个地点中总体呈现单峰模式分布(图3)。

各样地土壤真菌多样性分布差异不大(图4)，其中KEDN香农指数显著高于HN(P<0.05)； HN丰富度指数显著高于KNS和HB(P<0.05)。基于Bray-Curtis距离，利用NMDS分析发现细菌和真菌的群落组成在物种水平上均有显著差异(图5)。

图3 不同气候带森林的土壤细菌多样性指数分布特征

2.4 土壤微生物的群落构建特征

基于零模型方法，分析确定性过程与随机性过程在不同气候带土壤微生物群落构建中的相对重要性。结果表明(表2)，匀质性选择(homogeneous selection)对各样地细菌群落构建过程影响较大，具体为： 在KNS样地中占74.26%，KRDN样地中占52.94%，GS样地中占51.47%，HB样地中占92.65%，HN样地中占77.94%。因此，在土壤细菌群落构建过程中，确定性过程的相对贡献(52.94%～92.65%)显著高于随机性过程(7.35%～47.06%)。

未知主导的随机过程(undominated)，包括弱选择(weak selection)、弱扩散(weak dispersal)、分化(diversification)和漂变(drift)等过程对KNS(49.26%)、KEDN(36.76%)和HN(50.74%)3个样地的真菌群落影响较大。扩散限制(75.00%)对GS真菌群落构建影响较大， 匀质性选择(51.47%)对HB真菌群落构建影响更大。因此，在土壤真菌群落构建过程中，随机性过程的相对贡献(48.53%～90.44%)显著高于确定性过程(9.56%～51.47%)。

分析不同气候带森林土壤细菌群落和真菌群落结构的构建过程后发现，细菌群落构建主要受确定性因素影响； 而真菌群落结构由确定性过程和随机性过程影响，但随机性过程影响更大。

图4 不同气候带的森林土壤真菌多样性指数分布特征

图5 土壤细菌(a)和真菌(b)群落的NMDS分析

表2 决定性过程和随机性过程对土壤微生物群落的贡献率

2.5 影响土壤微生物群落结构的主要环境因子

利用CCA和Mantel test分析了影响土壤微生物群落结构的主要环境因素。CCA分析共得到9个环境因子(图6)，包括土壤pH值、全磷、全钾、有效磷、速效钾、铵态氮、硝态氮、植物香农指数和植物功能离散度。根据环境因子在CCA1轴的投影长度可知，土壤pH值、全磷和植物香农指数是影响细菌群落组成的重要因子(图6a)； 土壤pH、全磷、植物香农指数和全钾是影响真菌群落组成的重要因子(图6b)。利用Mantel test分析(表3)表明，细菌群落受土壤pH值的影响最大(r=0.826，P<0.001)，植物物种数和土壤全磷次之； 而真菌群落受植物物种数的影响最大(r=0.474，P<0.001)，土壤pH值和植物香农指数次之。

图6 土壤细菌群落(a)和真菌群落(b)与环境因子间的典范对应分析

表3 土壤细菌和真菌与环境因子的Mantel test分析

3 讨论

大量研究发现，土壤细菌优势菌群在不同生态系统中基本相似，例如变形菌门、酸杆菌门和放线菌门在高寒草甸土壤(刘晓,2016)、森林土壤(Zhangetal.， 2016)以及农田土壤(Shietal.， 2018)中占有主要地位。本研究中，5个地点的主要细菌门类大致相同，为变形杆菌门、酸杆菌门和放线菌门，HN样地中变形菌和酸杆菌的相对丰度较高，在KEDN放线菌门相对丰度最高； 在属水平，各样地优势属存在差异，Brodyrhizobium属在KNS样地相对丰度最高，Gp6属在KEDN与GS相对丰度最高，Gp2属在HB和HN样地相对丰度最高。研究发现变形菌门相对丰度与土壤碳、氮具有正相关关系(Zhangetal.， 2014)。

多数研究认为土壤酸杆菌相对丰度与土壤pH值呈负相关(Chuetal.， 2010； Griffithsetal.， 2011)，或无显著相关性(Liuetal.， 2015)，也可能是其他土壤因子相关(Navarreteetal.， 2013)，这可能是不同亚群酸杆菌或同一亚群不同细菌对土壤因子的响应不同(王光华等， 2016)。本研究中，KEDN放线菌相对丰度最高，这可能由于该样地具有较高的土壤碳、氮和生物量。土壤真菌群落的优势类群为担子菌门、子囊菌门和接合菌门，这与之前研究结果相似(Liuetal.， 2018； Silesetal.， 2016)，但土壤真菌群落组成在各研究地点存在差异。本研究发现，子囊菌门为温带针叶林优势菌群，担子菌门为暖温带针阔混交林、亚热带常绿落叶阔叶混交林和热带雨林优势菌群。这可能与土壤凋落物较少或针叶林凋落物较难降解，导致氮输入较低有关；也可能由于子囊菌对气候因子(如降水或温度)较敏感，且土壤pH值对子囊菌类群Pezizomycetes也有影响(Tedersooetal.， 2014)。

大多研究认为土壤因子和植被是影响微生物群落结构的主要因素。Nielsen等(2010)发现土壤性质变化对细菌群落和古菌群落有较强影响，而真菌群落与植物存在更密切关系。土壤pH值是影响土壤细菌多样性的主要因素(Griffithsetal.， 2011； Lauberetal.， 2009； Liuetal.， 2018)。本研究中，土壤细菌多样性在暖温带针阔混交林最高，这与Bahram等(2018)研究一致，即发现在全球表层土壤中，土壤细菌多样性在温带最高，随纬度梯度呈单峰分布。根据CCA和Manel test可知，土壤细菌群落与土壤pH值存在显著相关性，土壤pH值对细菌多样性的影响更大(r=0.826)。这可能由于细菌生长的最适pH值范围较窄(Rousketal.， 2010)，大多数细菌适宜在pH值6.5—7.5的环境中生长(徐志伟， 2015)，而在酸性土壤中其多样性较低(Fiereretal.， 2006)。

Shi等(2014)研究发现，在植物多样性最低的森林系统中真菌表现出较高的多样性，这可能由于在多样性较低的森林系统中真菌出现了高度的物种形成(Tedersooetal.， 2014)。多数真菌更偏好温暖潮湿、需氧和酸性的环境，以获得生长繁殖所需要的有机物和含氮化合物，且温度较高的地区其植物种类较丰富，具有较高的初级生产力和分解速率，因此微生物丰富度在热带地区更高(Waggetal.， 2014； Liangetal.， 2016)。Tedrrsoo等(2014)认为真菌丰富度与植物间的相关性并不是植物对真菌的直接影响，而是它们对气候和土壤因子的相似响应。植物对土壤微生物的影响主要表现为两个方面，一是通过改变土壤结构和土壤性质使微生物的生长环境发生变化，二是根系分泌物对微生物的影响(徐志伟， 2015)。土壤pH值对真菌群落的影响可能是直接或间接影响其他相关因子，如钙和其他阳离子浓度(Bahrametal.， 2018)。此外，本研究还发现，土壤全磷、全钾、有效磷、速效钾、铵态氮和硝态氮与土壤细菌和真菌群落结构也存在相关性。这在其他研究中也有相似结论，如Horner-Devine等(2004)发现土壤磷酸盐和铵离子浓度变化影响细菌群落组成；丁建莉(2017)发现土壤真菌群落与速效钾、硝态氮和速效磷相关性较高。这可能是不同真菌类群对特定土壤条件表现出不同的偏好(Tedersooetal.， 2014)。

确定性过程和随机性过程是微生物群落构建的2个主要生态过程。然而，随着地理尺度、生境和物种类型的不同，对微生物群落的相对影响可能会不同(Xiongetal.， 2012； Bardgettetal.， 2014； Wangetal.， 2016)。以往研究认为，环境选择对微生物群落的影响要大于扩散限制的影响(Finlayetal.， 2002)。Wang等(2016)认为环境选择对微生物群落结构的影响占主导地位，而扩散限制的作用则依赖于物种，如繁殖体形状和大小以及对紫外线敏感性，可能会对物种间长距离扩散产生不同影响(Finlayetal.， 2002)。也有研究发现，真菌群落的生物地理差异可能受到气候因素和不同分布地区寄主植物与真菌间营养联系的影响(Tedersooetal.， 2014)，如Itan等(2016)发现尘埃降雨将多种真菌群落从北非传递到地中海东部； EcM和病原真菌直接通过寄主植物获取大部分碳，而腐生真菌更依赖土壤有机质(Plettetal.， 2011)； Bahram等(2015)发现环境梯度较窄和空间距离较小会增加随机过程的影响。本研究中，土壤细菌群落由确定性过程主导，真菌群落由确定性过程和随机性过程决定，且随机性过程更重要。

4 结论

我国温带、暖温带、亚热带和热带森林土壤的细菌和真菌的多样性和群落结构都存在显著差异，其中土壤细菌多样性具有显著差异，在沿纬度分布的5个研究地点中呈单峰模式分布，即在暖温带针阔混交林中最高； 土壤真菌香农指数在温带针叶林中最高，土壤真菌丰富度在热带雨林中最高。土壤细菌和真菌具有不同的群落构建特征，其中不同气候带的森林土壤细菌群落主要由确定性过程主导，土壤真菌群落结构主要受随机性过程影响。土壤pH值和植物多样性是影响森林土壤微生物多样性的重要因素，其中pH值是影响细菌多样性的重要因素，pH值、植物多样性是影响真菌多样性的重要因素。