HPLC-MS/MS法检测小鼠体内京尼平苷血药浓度的价值分析

陈小康，孙文清，王 康，张又枝,2，张玉霖,2⋆

（1. 湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100 ；2. 鄂南特色中药湖北省工程研究中心，湖北 咸宁 437100）

京尼平苷是一种环烯醚萜葡萄糖苷，它是中药栀子干燥果实中的主要活性成分。京尼平苷在其他植物中也广泛存在，如肉苁蓉、杜仲、牛膝、黄毛耳草等[1]。京尼平苷具有降血糖、抗抑郁、抗癌、抗炎、抑制动脉粥样硬化等多种药理作用[2-5]。目前报道的检测京尼平苷血药浓度的方法多为高效液相色谱法[6]（HPLC）和液相色谱-串联质谱法[7]（LC-MS/MS）。本文在既有文献的基础上，通过优化改进建立一种能快速、准确检测小鼠血浆中京尼平苷血药浓度的方法，绘制京尼平苷在小鼠体内随时间代谢的平均血药浓度-时间曲线，得到其主要药代动力学参数，为相关研究和临床用药提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪 器 液 相 色 谱- 质 谱 仪（LC-MS/MS 8040）（由日本岛津公司生产），1730R 微量高速冷冻离心机（由丹麦labogene 公司生产）、AUY220 型电子天平（由日本岛津公司生产）。

1.1.2 试剂 HPLC 级乙腈、甲酸（由美国Fisher公司生产），京尼平苷（HPLC ≥98% ；批号：G101668 ；由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供），芍药苷（HPLC ≥98% ；批号：B21148 ；由上海源叶生物科技有限公司提供）。

1.1.3 实验动物 昆明鼠27 只（体重为20 ～25 g），购于北京斯贝福生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK( 京)2016-0002。

1.2 方法

1.2.1 测定条件、溶液配制与血样处理

1.2.1.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；流动相：乙腈-乙酸铵（5 mmol/L，含0.05% 甲酸）（30:70）；流速：0.8 mL/min ；柱温：30℃；进样量：5 μL。

1.2.1.2 主要质谱条件 液相质谱-电喷雾离子源（ESI），离子多反应离子（MRM）检测；接口电压：4.5 kV；雾化气流量：3 L/min；干燥气流量：15.0 L/min；DL 温度：250℃；CID 气：230 kPa。定量离子对：京尼平苷：m/z 406.2 ～227.2（CE ：-15）；芍药苷：m/z 498.4 ～179.15（CE ：-20）。

1.2.1.3 京尼平苷储备液的配制 精密称取1.5 mg的京尼平苷标准品，用44.0 μg/mL 的芍药苷内标溶液进行超声溶解，稀释成含内标的105.0 μg/mL京尼平苷储备液。

1.2.1.4 血浆样品的处理 取100 μL 血浆样品，加入300 μL 内标溶液（利用其溶剂乙腈沉淀蛋白），涡旋振荡5 min，在4℃下离心（13 000 r/min）处理10 min，取上清液300 μL。在上清液中加入100 μL 的蒸馏水，涡旋混匀后经微孔滤膜过滤，按照拟定条件进行测定和分析。

1.2.2 分析方法考察

1.2.2.1 专属性 分别取处理好的空白血浆、空白血浆+ 内标溶液、空白血浆+ 内标溶液+ 京尼平苷质控样品、昆明鼠以150 mg/kg 的剂量灌胃京尼平苷后采集的血浆样品，按拟定条件进行测定和分析，得到色谱图。

1.2.2.2 标准曲线及定量下限 分别精密量取一定量的京尼平苷储备液，用内标溶液稀释至300 μL，制得系列标准溶液。在各溶液中加入100 μL 的空白血浆后，制成浓度分别为6037.5 ng/mL、3150.0 ng/mL、1575.0 ng/mL、787.5 ng/mL、3 7 8.0 n g/m L、1 2 6.0 n g/m L、6 3.0 n g/m L、31.5 ng/mL、15.75 ng/mL、7.35 ng/mL 的系列标准血浆样品，并按照1.2.1.4 项“血浆样品处理”方法自涡旋振荡5 min，记录峰面积。以京尼平苷与内标的峰面积比为纵坐标，以京尼平苷浓度为横坐标，进行加权线性回归处理（1/x2）。

1.2.2.3 精密度和准确度 配制并测定高（1575.0 ng/mL）、 中（378.0 ng/mL）、 低（63.0 ng/mL）及定量下限（7.35 ng/mL）4 个浓度的京尼平苷质控样品，每个浓度均有5 个样本，连续测定3 d，考察该方法的精密度和准确度。

1.2.2.4 提取回收率 取空白血浆100 μL，加入300 μL 的乙腈，涡旋振荡5 min，在4℃下离心（13 000 r/min）处理10 min，取上清液100 μL。在上清液中加入京尼平苷储备液和内标溶液，制得京尼平苷浓度为1575.0 ng/mL、126.0 ng/mL、15.75 ng/mL 的血浆样品。取血浆样品300 μL，加入蒸馏水100 μL，涡旋混匀，经微孔滤膜过滤后，按拟定条件进行测定和分析。配制相同浓度的质控血浆样品并进样分析。测定京尼平苷峰面积与内标峰面积的比值，分别为A 和B，提取回收率=B/A%。

1.2.3 药物体内研究 按照给药后取血时间的不同将27 只昆明鼠分为5 min 组、15 min 组、25 min组、35 min 组、45 min 组、55 min 组、120 min 组、240 min 组、360 min 组，每组各有小鼠3 只。将所用小鼠禁食不禁水12 h 后用150 mg/kg 的京尼平苷灌胃，各组在相应时间点经眼眶取血后，用含有肝素钠的EP 管收集全血，在4℃的离心机中以10 000 r/min 的转速离心20 min，按照1.2.1.4项“血浆样品处理”方法进行处理。根据测定结果，用GraphPad Prism 9 软件绘制平均血药浓度- 时间曲线，用R 语言[8]按照非房室模型估算各组小鼠主要的药代动力学参数。

2 结果

2.1 分析方法评价

2.1.1 专属性 在拟定条件下，京尼平苷和内标（芍药苷）的保留时间分别为4.23 min、4.98 min，化合物峰形良好，血浆内源性物质、内标（芍药苷）和京尼平苷之间互不干扰。

2.1.2 标准曲线及定量下限 京尼平苷在7.35 ～6037.5 ng/mL 范围内线性关系良好，回归方 程：y=0.0124x+0.72，（r2=0.999），定 量 下 限为7.35 ng/mL（S/N ＞10）。

2.1.3 精密度和准确度 京尼平苷定量下限的日内相对标准偏差（RSD）为14.06%，日间RSD为15.85%，准确度为89.34% ；高、中、低浓度京尼平苷的日内RSD 均＜10.31%，日间RSD均＜13.03%，准确度在95.65% ～102.34% 之间。这表明，该检测方法具有良好的精密度和准确度。

2.1.4 提 取 回 收 率 京 尼 平 苷 低、 中、 高 浓度的提取回收率分别为（85.61±1.20）%、85.06±3.93）%、（89.31±5.07）%。 这 表 明，京尼平苷的提取回收率良好且比较稳定。

2.2 药物体内研究

用京尼平苷为昆明鼠灌胃后其平均血药浓度- 时间曲线见图1。其主要药代动力学参数：t1/2=49.5 min、Cmax=3151.27 ng/mL、Tmax=25.0 min、MRT（mean residence time， 平 均 滞 留 时间）=70.76 min、AUC0-∞=208427.3 ng·mL-1·min-1、AUC0-t=256305.6 ng·mL-1·min-1。

图1 昆明鼠体内京尼平苷平均血药浓度-时间曲线

3 讨论

本试验发现，采用HPLC-MS/MS 法检测小鼠体内京尼平苷的血药浓度时，在流动相中添加0.05%甲酸时的检测效果最佳。当流动相中乙腈占50%时，京尼平苷和内标芍药苷的色谱峰在4.2 min 时发生重叠。通过降低乙腈所占的比例，两个色谱峰渐渐分离。当乙腈所占的比例为30% 时，京尼平苷和芍药苷的色谱峰具有较好的峰形且出峰时间良好，最终的色谱条件为乙腈- 乙酸铵（5 mmol/L，含0.05% 甲酸）（30:70）。本试验在血浆样品的处理上，借鉴了相关文献[7,9]中的处理方法。根据本实验室的已有条件，以氮气吹干代替真空浓缩溶剂进行样品浓缩时，发现样品的处理较为繁琐费时，且可能使误差产生的几率增加。通过对本试验方法进行优化改进，使处理血浆样品的时间大幅减少且简化了操作步骤。在处理血浆样品的最后，为了避免待测样品因检测样本数量较大、等待时间长而导致有机相挥发，特在上清液中加入了100 μL 的蒸馏水。本研究用LC-MS/MS 测定并建立了小鼠体内京尼平苷平均血药浓度随时间变化的曲线，并得出了相关的药代动力学参数，能够为京尼平苷在小鼠体内的相关研究提供参考数据。

综上所述，采用LC-MS/MS 并以上文中的色谱条件检测小鼠体内京尼平苷血药浓度的价值较高，具有操作简单、专属性强、稳定性和精密度高等优点。