响应面法优化藜麦发酵饮料配方的研究

陆 阳

（中央储备粮通辽东郊直属库有限公司，内蒙古 通辽 028012）

藜麦是藜科的一种植物，已经有近7 000年的种植历史[1-2]，它具有特殊的营养特性，并含有高浓度的蛋白质、必需氨基酸和不饱和脂肪酸，特别是赖氨酸和蛋氨酸含量最高[3-5]，它还含有多种维生素，矿物质和其它有益化合物，该作物被认为是最好的植物蛋白来源之一。此外，藜麦中还含有皂苷、多酚、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、黄酮等多种功能性成分，同时含有丰富的膳食纤维，食用后使人产生饱腹感，非常适合糖尿病人群长期食用[6-9]。研究表明，长期食用藜麦可以有效地缓解高血压、高血糖、心脏病等，还具有增强人体免疫力、补充营养及减肥等功效。本文以藜麦为发酵原料接种乳酸菌研制藜麦发酵饮料，为藜麦产品开发进行了研究探索。

1 材料与方法

1.1 试验材料

藜麦，吉林省中谷藜麦实业有限公司提供；蔗糖、柠檬酸、黄原胶均为食品级；试验菌种，乳酸菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；MRS培养基，青岛海博生物技术有限公司；GABA标准品（纯度≥98%），北京索莱宝科技有限责任公司；邻苯二甲醛，上海笛柏有限公司；乙腈，上海笛柏有限公司；2-巯基乙醇，上海笛柏有限公司；四氢呋喃，上海笛柏有限公司；MRS培养基，青岛海博生物技术有限公司；乙酸钠，天津欧博凯化工有限公司；碳酸钙，天津欧博凯化工有限公司；硼酸、无水乙醇、甲醇均为国产分析纯。

1.2 试验仪器

FA1204B电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；BL-50A立式压力蒸汽灭菌锅，上海东亚压力容器制造有限公司；SW-CJ-2FD型净化工作台：上海新苗医疗器械制造有限公司；RE-2000旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HHS型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司；Sigma3K15型高速离心机，北京五洲东方科技发展有限公司；SHP-250型生化培养箱，上海精宏试验设备有限公司；FW100型万能粉碎机，瑞安市永历制药机械有限公司；HZQ-C空气浴振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；SHZ-D（III）循环水式真空泵，巩义予华仪器有限责任公司；D-30M型高压均质机，美国Phd科技公司；高效液相色谱仪Waters2695，美国Waters公司。

1.3 试验方法

1.3.1 藜麦发酵饮料加工工艺

藜麦→挑选→粉碎→加水→放入摇床→接种乳酸菌→发酵→离心→过滤 （无菌）→浓缩→发酵原液→调配→均质→灌装密封→杀菌→冷却→成品

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 藜麦粉的制备

挑选籽粒完整、无虫蚀的藜麦进行粉碎，过80目标准筛，收集过筛后的样品备用。

1.3.2.2 菌种活化

用无菌移液枪吸取200 μL液体培养基，滴入菌种保藏管内，使其呈悬浮状态，然后将乳酸菌菌液接种在MRS培养基中平板涂布，在37℃下培养48h后，将培养基于9 000 r/min的高速冷冻离心机中离心10 min，制得菌泥，并用无菌水来重新溶解调整菌液浓度在108CFU/mL作为发酵剂。

1.3.2.3 发酵液制备

参考先前研究的发酵液制备方法[10]，准确称取25 g粉碎好的藜麦粉，加入灭菌处理后的去离子水150 mL，放置于发酵罐内，接入4%乳酸菌，发酵温度34℃，摇床转速140 r/min，发酵24 h，将发酵液放入5 000 r/min的离心机内离心15 min，发酵液进行过滤、浓缩，得到藜麦发酵液。

1.3.2.4 调配、均质、灌装、杀菌

将上述原辅料按优化实验所得的最佳比例进行调配，在30 MPa的条件下均质两次，于100 mL的玻璃瓶进行灌装，95℃杀菌15 min。

1.3.3 液相色谱法测γ-氨基丁酸含量

1.3.3.1 发酵饮料预处理

将发酵饮料放入8 000 r/min的离心机内离心15 min，上清液进行旋转蒸发器进行浓缩，过0.45 μm滤膜，超声波除泡10 min备用。

1.3.3.2 标准溶液的制备

按参考文献[11]的方法进行标准溶液配制，准确称取0.1 g γ-氨基丁酸标准品，用蒸馏水溶解并定容到100 mL,过0.45 μm滤膜，用超声波除泡10 min备用。

1.3.3.3 OPA衍生液制备

称取0.1 g邻苯二甲醛（OPA），用1 mL乙腈溶解，然后加入130 μL巯基乙醇最后用 0.4 mol/L的硼酸缓冲液定容到10 mL备用。

1.3.3.4 衍生化反应

取预处理好的样品20 μL，加入100 μL OPA衍生液，震荡5 s后静置3 min，进样20 μL。

1.3.3.5 色谱分析条件

色谱柱：Kromasil-C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相：流动相A为乙酸钠溶液加三乙胺用5%醋酸调pH 7.2±0.02，最后加入四氢呋喃混合后过滤备用；流动相B为乙酸钠溶液用5%醋酸调pH 7.2±0.02，再添加乙腈和甲醇使其三者比例为 1：2：2（体积比），混合后过滤膜备用。设置液相色谱流动相流速为1 mL/min,洗脱程序方法按表1进行，柱温 40 ℃，检测波长 338 nm[12～14]。

表1 梯度洗脱程序参数表

1.3.4 藜麦发酵饮料配方单因素实验

选取蔗糖添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、柠檬酸添加量 （0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）、黄原胶添加量 （0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、发酵液添加量（10%、30%、50%、70%、90%），四个因素不同水平进行单因素试验，以感官评分为指标，研究藜麦发酵饮料单因素最佳配方。

1.3.5 藜麦发酵饮料配方响应面优化实验

在单因素试验的基础上，选取蔗糖、柠檬酸、黄原胶、发酵液添加量4个因素，以感官评分作为实验设计的响应值，根据Box-Benhnken利用四因素三水平的实验设计优化藜麦发酵饮料配方[15-16]。响应面设计实验因素及水平见表2。

表2 响应面试验因素水平设计表

1.3.6 藜麦发酵饮料理化指标及微生物指标测定

1.3.6.1 理化指标测定

酒精度测定参照GB/T 394.2-2008对藜麦发酵饮料进行酒精度的测定。

pH测定参照GB/T 5009.237-2016对藜麦发酵饮料进行pH值的测定。

1.3.6.2 微生物指标测定

藜麦发酵饮料菌落总数检测参照GB/T 4789.2-2016对藜麦发酵液进行菌落总数测定。

藜麦发酵饮料大肠菌群检测参照GB/T 4789.3-2016对藜麦发酵液进行大肠菌群测定。

藜麦发酵饮料致病菌检测参照GB/T 4789.4-2016进行沙门氏菌检验、GB/T 4789.10-2016进行金黄色葡萄球菌检验、GB/T 4789.15-2016进行霉菌检验和酵母计数。

1.3.7 感官评定

请10位专业的食品感官评价人员对藜麦发酵饮料进行专业的食品感官评定，感官指标包括藜麦发酵饮料的色泽、口感、气味及组织状态（是否有明显杂质），评价满分设定为100分，按照评分标准进行评分。评分标准见表3。

表3 藜麦发酵饮料感官评分标准

1.3.8 数据处理

本文所使用的图片均采用Origin 7.5制得，结果采用SPSS22.0软件对两组数据间进行方差分析：p＜0.01表示差异极显著，p＜0.05表示差异显著，数据具有统计学意义。使用Design-Expert 8.0软件进行响应面试验设计、优化和分析，每组试验均做了三组平行试验。

2 结果与分析

2.1 藜麦发酵饮料配方单因素结果分析

2.1.1 蔗糖添加量对感官评分的影响

蔗糖添加量单因素实验结果见图1，蔗糖添加太少不足以中合发酵饮料中的酸味，从而影响口感。但蔗糖添加量过多则会影响藜麦发酵后饮料独特的酸味，选择蔗糖添加量为5%左右为宜。

图1 蔗糖添加量对感官评分的影响

2.1.2 柠檬酸添加量对感官评分的影响

柠檬酸添加量单因素实验结果见图2，由图2可知藜麦经发酵后所产生的酸味比较单一，适当地添加柠檬酸会增强成品的风味，添加太少风味较差，添加太多则会影响发酵后所产生的独特酸味，从而影响口感。选择柠檬酸添加量为0.03%左右为宜。

图2 柠檬酸添加量对感官评分的影响

2.1.3 黄原胶添加量对感官评分的影响

黄原胶添加量单因素实验结果见图3，由图3可知黄原胶添加太多，饮用时产品过于粘稠，口感会差，黄原胶添加过少，成品口感不细腻且不稳定。选择黄原胶添加量为0.15%左右为宜。

图3 黄原胶添加量对感官评分的影响

2.1.4 发酵液添加量对感官评分的影响

发酵液添加量单因素实验结果见图4，由图4可知由于藜麦发酵后口感独特，添加量太多，饮用时产品中藜麦的风味太浓，口感较差。添加太少又不具藜麦发酵后的独特风味，选择发酵液添加量为50%左右为宜。

图4 发酵液添加量对感官评分的影响

2.2 响应面优化藜麦发酵饮料配方结果分析

2.2.1 响应面设计及试验结果

响应面设计及试验结果见表4。

表4 响应面优化试验结果

2.2.2 回归模型方差分析结果

对实验结果进行回归分析，并对各因素回归拟合后得到如下回归方程：Y=92.80+2.67A-1.92B-1.17C-1.08D+0.50AB+0.75AC+3.25AD-0.50BC+0.25BD+0.25CD-5.15A2-7.02B2-2.40C2-3.03D2

对此回归模型进行方差分析，结果见表5。由表5可得出回归模型R2=0.9736，由方差分析可知回归模型的p值＜0.01，说明此回归方程模型差异极显著，模型实际值与预测值拟合较好。失拟项p=0.2535＞0.05，不显著，试验误差较小。四个因素中蔗糖、柠檬酸、黄原胶及发酵液添加量为极显著，由F值可知各因素对感官评分影响的强弱为发酵液添加量＞柠檬酸添加量＞蔗糖添加量＞黄原胶添加量。

经Design-expert软件对回归方程的分析，得到藜麦发酵饮料最佳配方为：蔗糖添加量5.33%，柠檬酸添加量0.032%，黄原胶添加量0.14%，蔗糖添加量5%，发酵液添加量50.16%，考虑到实际可行性调整为蔗糖添加量5%，柠檬酸添加量0.03%，黄原胶添加量0.15%，发酵液添加量50%，此时产品感官评分为93，与预测值相接近，表明此配方具有可行性。

2.3 γ-氨基丁酸发酵饮料色谱图及标准曲线

采用液相色谱法对GABA（γ-氨基丁酸）进行分析，图5为GABA标准品的色谱图。从图5中我们可以看出，GABA的保留时间为5.8 min左右，标准品色谱图中目标峰分离效果好，峰型对称。图6为发酵饮料色谱图，GABA的保留时间为5.7 min左右，图中可以看出GABA发酵饮料中可检测物质种类较多，但是GABA与各物质可以清晰、有效地分离并且峰型较好。说明该高效液相方法可以用于GABA检测并计算其含量。

图5 GABA标准品色谱图

图6 发酵饮料的色谱图

标准曲线是以GABA标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标所绘制的，如图7所示。由图7得到回归方程为Y=8853X-3.2011，线性相关系数R2=0.9998，当 GABA 浓度在（0.005～0.1）mg/mL 范围内线性良好，经计算发酵饮料中GABA含量为0.625 mg/mL

图7 GABA标准曲线

表5 回归模型及方差分析

2.4 藜麦发酵饮料感官评定及卫生学指标测定

2.4.1 藜麦发酵饮料卫生学检测指标

按照国家标准对藜麦发酵液中菌落总数和大肠菌群进行检测，检测结果如表6所示。

表6表明本试验制得的藜麦发酵饮料的清洁状态较好，符合国家卫生标准，可以放心饮用。

2.4.2 藜麦发酵饮料理化指标

按照国家标准，藜麦发酵饮料pH和酒精度检测结果如表7所示。

表6 藜麦发酵液中菌落总数和大肠菌群的含量

表7 藜麦发酵饮料pH和酒精度检测结果

2.4.3 藜麦发酵饮料感官评定

本试验所研制的藜麦发酵饮料经过10名专业食品感官评价人员的感官评定，评分结果表明本试验制得的藜麦发酵饮料口感较好，可被大众接受。

3 结论及展望

本试验利用响应面法对藜麦发酵饮料配方进行优化，得到最佳配方为蔗糖添加量5%，柠檬酸添加量0.03%，黄原胶添加量0.15%，发酵液添加量50%。此条件下测得成品中GABA含量为0.625mg/mL，该产品口感酸甜适中，既有藜麦和乳酸菌发酵后独特的风味，也有一定功能性，试验为藜麦产品的开发奠定了基础，具有一定的应用前景和实际意义。

藜麦经过发酵后，会产生许多发酵残渣，这些残渣中也含有很多营养物质。如果直接将这些残渣丢弃，会造成很大的资源浪费，为了避免这种资源浪费，可将其用于藜麦饼干、代餐粉等产品开发，以期达到合理利用藜麦资源并创造更大经济效益目的。