响应面法优化美国灵芝姬松茸复合酸奶加工工艺*

王 鑫，成学冰，魏玉凯，王佳燕，李 硕，韩都柱，王 鑫，王琳琳*

（河北农业大学理工学院，河北 黄骅 061100）

美国灵芝中的灵芝多糖具有免疫调节[1]、降低血糖[2]、抗氧化[3]和解酒护肝[4-6]作用。姬松茸含有人体所需的8种必需氨基酸以及多种维生素，可以调节人体免疫功能[7-8]、改善学习记忆力、促进人骨髓造血功能以及抗疲劳[9]、抗肿瘤[10-11]等生物功效。

酸奶是一种由乳酸菌经发酵而成的乳制品，具有独特风味。随着生活水平的提高，人们更加注重食品营养问题[12]。现在市场上普遍存在的是原味酸奶和水果酸奶，其中，水果酸奶在一定程度上提高了酸奶的营养价值，增强了一定的口味。但食用菌酸奶很少涉足，本次实验主要采用美国灵芝和姬松茸的液态培养物和菌丝球为原料，采用单因素试验和响应面试验对其加工工艺进行优化，研究一款新型食用菌酸奶。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料

美国灵芝、姬松茸由本实验室提供；嗜热乳酸链球菌（Streptococcus thermophilus）与保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)选自川秀乳酸菌酸奶发酵粉；奶源采用伊利利乐包纯牛奶。

1.1.2 试验仪器

SW-CJ-1FB无菌操作台，杭州川一实验仪器有限公司；SPX-250B-D振荡培养箱，上海博远实业有限公司；BAS224S电子天平，赛多利斯科技有限公司；DL-6M冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 美国灵芝、姬松茸复合酸奶加工工艺流程

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 美国灵芝、姬松茸菌丝制备

（1）液态PDA培养基制备：将土豆去皮切条，称取200 g土豆条放入锅中，加入1 000 mL水，加热煮沸25 min，用四层纱布趁热过滤，取滤液，定容至1 000 mL。轻微加热，加入20 g白砂糖，搅拌，待完全溶解后补充水分至1 000 mL。趁热将其分装到250 mL锥形瓶中，每瓶100 mL，用封口膜将三角瓶封好，于灭菌锅中121℃灭菌20 min[13]。冷却备用。

（2）美国灵芝、姬松茸菌丝培养：在已培养好的美国灵芝和姬松茸平板上，切取边长为1 cm的正方形小块若干，每瓶液态PDA培养基接种三块，美国灵芝、姬松茸各接种5瓶。置于160 r/min摇床培养6 d，获得美国灵芝菌丝发酵液、姬松茸菌丝发酵液。

（3）美国灵芝、姬松茸菌丝发酵液制备：将1.2.2.1（2）中获得的美国灵芝菌丝发酵液、姬松茸发酵液置于组织捣碎机中捣碎，得到美国灵芝匀浆菌丝发酵液、姬松茸匀浆菌丝发酵液。

1.2.2.2 酸奶制备

（1）调配、灭菌：将新鲜牛奶放入锅中加热，随后加入7%白砂糖。均质，于60℃加热30 min灭菌。

（2）冷却、接种：a.待温度冷却至 40～45 ℃时加入川秀乳酸菌发酵剂，按照每750 mL牛奶加入1 g发酵剂。充分混匀后，分装到150 mL酸奶瓶中，每瓶装入130 mL。b.并按照试验设计比例分别添加美国灵芝匀浆菌丝发酵液、姬松茸匀浆菌丝发酵液。

（3）保温发酵：将接种后的酸奶瓶按照试验设计温度时间放入培养箱中进行发酵。

（4）冷却、后熟：待发酵好的酸奶稍冷却后放入4℃冰箱内再发酵12 h[14]，即得酸奶成品。

1.2.3 单因素试验设计

1.2.3.1 美国灵芝、姬松茸比例的确定

以美国灵芝、姬松茸总添加量为5%，将美国灵芝、姬松茸的比例按照 1∶2、1∶1、2∶1 分别加入到装有130 mL牛奶（糖添加量7%，发酵剂添加量750 mL/g）的150 mL酸奶瓶中，于43℃发酵7 h，对成品进行感官评定、持水力和酸度的测定。

1.2.3.2 美国灵芝、姬松茸总添加量的确定

以美国灵芝、姬松茸比例为1∶1，将美国灵芝、姬松茸总添加量按照3%、5%、8%分别加入到装有130 mL牛奶（糖添加量7%，发酵剂添加量750 mL/g）的150 mL酸奶瓶中，于43℃发酵7 h，对成品进行感官评定、持水力和酸度的测定。

1.2.3.3 发酵温度的确定

以美国灵芝、姬松茸比例为1∶1和总添加量为5%加入到装有130 mL牛奶（糖添加量7%，发酵剂添加量750 mL/g）的150 mL酸奶瓶中，分别于39℃、41℃、43℃和45℃培养7 h，对成品进行感官评定、持水力和酸度的测定。

1.2.3.4 发酵时间的确定

以美国灵芝、姬松茸比例为1∶1和总添加量为5%加入到装有130 mL牛奶（糖添加量7%，发酵剂添加量750 mL/g）的150 mL酸奶瓶中，于43℃分别培养5 h、6 h、7 h和8 h，对成品进行感官评定、持水力和酸度的测定。

1.2.3.5 统计学分析

试验设3次重复，数据采用平均值±标准差表示方法，显著性差异采用Duncan多重比较法进行比较[15]。

1.2.4 响应面试验设计

根据单因素试验结果确定四因素三水平试验，以感官评定、持水力和酸度为综合依据进行优化，因素水平设计如表1所示。

表1 Box-Beheken设计因素水平及水平编码

1.3 评价指标

1.3.1 感官评定

参考屈茹琪[16]感官评定标准，采用评分分析法对美国灵芝、姬松茸复合酸奶的乳清析出情况、组织状态、风味和滋味进行评定，评分为百分制，由10名受过专业培训的学生组成评定小组，按照表2的评定标准进行评定，结果去除最高分和最低分，剩余分数取平均值，试验结果保留两位小数，即得到产品最终的感官评定分数。

表2 美国灵芝姬松茸复合酸奶的感官评定标准

1.3.2 持水力

持水力反应蛋白凝胶网络对水的保持能力，持水力越高，酸奶质地越好，不易发生蛋白析出[17]。

参考李海平等[17]持水力测定方法，持水力的测定方法如下：

取20 g酸奶样品于离心管中，以3 500 r/min速度离心30 min，去上清液称取沉淀物质质量。持水力公式如下：

式中：AW为持水力，%；m1为离心后沉淀物总质量；m2为样品总质量。

1.3.3 酸度

酸奶酸度可以保证酸奶产品的风味、口感、粘稠度等，一般情况下酸度在60～100°T的酸奶口感较好，国家标准中对酸奶酸度的要求是≥70°T[12,18]。

参照GB 5009.239-2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》进行酸度滴定[18]，酸奶酸度的测定方法如下：

（1）氢氧化钠溶液的标定。准确称取0.40～0.50g基准试剂邻苯二甲酸氢钾三份，置于锥形瓶中标号，加20～30 mL蒸馏水溶解后，加一滴酚酞指示剂。用配置好的氢氧化钠溶液分别滴定至溶液呈红色，30s内不褪色。记录每次消耗的氢氧化钠溶液的体积数。

式中：C为氢氧化钠标准溶液的浓度；m1为基准试剂邻苯二甲酸氢钾的质量；V1为滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积；204.22：邻苯二甲酸氢钾的摩尔质量。

（2）酸度测定。称取10 g样品，置于150 mL锥形瓶中。加20 mL蒸馏水，混匀。再加2.0 mL酚酞溶液，混匀。用氢氧化钠标准溶液滴定至微红色，并在30 s内不褪色。记录消耗的氢氧化钠标准溶液的体积数，重复三次。

式中：X为式样的酸度，单位为度；C2为氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度；V2为滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积；m2为试样质量；0.1为酸度理论定义氢氧化钠的摩尔浓度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 美国灵芝、姬松茸添加比例对酸奶质量影响

通过表3分析得出，菌比例为1∶1时，酸奶质量较高。菌比例为1∶1时，感官评分最高，此时，酸奶外观细腻，无乳清析出且口感较好无异味；同时菌比例为1∶1时，持水力明显高于其它两组；菌比例为1∶1时，酸度在国家标准规定范围内高于其它两组。因此，综合感官评分、持水力、酸度，选择美国灵芝：姬松茸＝1∶1为最佳菌比例较为合适。

表3 菌比例对持水力、酸度以及感官评定的影响

2.1.2 美国灵芝、姬松茸总添加量对酸奶质量影响

通过表4分析得出，美国灵芝、姬松茸总添加量为5%时，酸奶质量较高，感官评分也最高，为85.26左右，在3%和8%时感官评分处于同一水平面，均低于总添加量5%条件下感官评分；菌种总添加量为3%、5%时持水力处于同一水平面，优于8%时的持水力；酸度在3%、5%条件下处于同一水平面。因此，综合感官评分、持水力、酸度，选择总添加量为5%较为合适。

表4 总添加量对持水力、酸度以及感官评定的影响

2.1.3 发酵温度对酸奶质量的影响

通过表5分析得出，发酵温度为43℃时，酸奶质量较高。在39℃下，感官评定得分小于其他三组且其它三组处于同一水平面并无明显区别；持水力在39℃、41℃、43℃和45℃四个温度变化下仍处于同一水平面；在41℃下酸度较其它三个温度下较低，45℃最高，但是考虑到实际工业生产中节约能源、降低成本的需求和原则且综合感官评分、持水力、酸度，选择发酵温度为43℃较为合适。

表5 发酵温度对持水力、酸度以及感官评定的影响

2.1.4 发酵时间对酸奶质量的影响

通过表6分析得出，发酵时间为7 h时，酸奶质量较高。感官评定得分在7 h和8 h达到最高，处于同一水平面且高于其他两组；在四种发酵时间下，持水力处于同一水平面；5 h下酸度最低，且一般情况下酸度在60～100°T的酸奶口感较好，国家标准中对酸奶酸度的要求是≥70°T[12]。8 h条件时超出范围，故排除。因此，综合感官评分、持水力、酸度，选择发酵时间7 h较为合适。

表6 发酵时间对持水力、酸度以及感官评定的影响

综上所述，美国灵芝姬松茸复合酸奶在加工过程中选择的最佳加工条件为：菌比例（美国灵芝：姬松茸）=1∶1、菌种总添加量5%、发酵温度43℃、发酵时间7 h。

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 响应面优化试验对感官评定的影响

2.2.1.1 响应面优化试验设计与感官评定结果

根据单因素试验结果，确定菌比例、总添加量、发酵时间、发酵温度为试验因素。根据Box-Beheken试验设计水平方案（表1），采用四因素三水平响应面分析，结果见表7。

表7 响应面优化试验设计对感官评定结果

2.2.1.2 感官模型检验

采用Design-Expert 12软件对于表进行多项拟合回归，得到感官评定Y1与A菌比例、B菌总添加量、C发酵温度、D发酵时间的二元多次回归模型为Y1=91.04+4.66A+0.3560B+1.03C-2.53D-0.2914AB+0.0126AC-3.83AD-0.0347BC+3.20BD-0.5375CD-7.07A2-3.58B2-2.47C2-1.56D2

Box-Beheken试验结果方差分析见表8。

由表8可知交互项（AD、BD）对酸奶感官评分较为显著，且模型显著，说明其与实际情况具有较高的吻合度，失拟项差异不显著，说明方程可以更好的用于美国灵芝姬松茸复合酸奶工艺的优化。

表8 感官评定Box-Beheken试验结果方差分析

为验证方差分析结果，对交互项（AD、BD）显著的曲面图和等高线图进行分析，曲面的陡峭程度反映对感官评分的影响程度，越陡，说明影响越大；而等高线反映了各因素交互作用的大小，椭圆表示作用显著[19]。结果如图1～图2所示。

图1 菌比例和发酵时间交互影响感官评分的曲面图和等高线

图2 总添加量和发酵时间交互影响感官评定的曲面图和等高线

由图1和图2分析可知，根据感官评定得出的美国灵芝姬松茸复合酸奶的最佳加工工艺为：菌比例（美国灵芝：姬松茸）=226：200、菌种总添加量为4.779%、发酵温度为42.998℃、发酵时间为7.358 h，此时预测感官评分为89.742。

2.2.2 响应面优化试验对持水力的影响

2.2.2.1 响应面优化试验设计与持水力结果

根据单因素试验结果，确定菌比例、总添加量、发酵时间、发酵温度为试验因素。根据Box-Beheken试验设计水平方案（表1），采用四因素三水平响应面分析，结果见表9。

表9 响应面优化试验设计对持水力结果

2.2.2.2 持水力模型检验

采用Design-Expert 12软件对于表进行多项拟合回归，得到持水力Y2与A菌比例、B菌总添加量、C发酵温度、D发酵时间的二元多次回归模型为

Box-Beheken试验结果方差分析见表10。

表10 持水力Box-Beheken试验结果方差分析

由表10可知交互项（AC）对酸奶持水力较为显著，且模型显著，说明其与实际情况具有较高的吻合度，失拟项差异不显著，说明方程可以更好地用于美国灵芝姬松茸复合酸奶工艺的优化。

为验证方差分析结果，对交互项（AC）显著的曲面图和等高线图进行分析，曲面的陡峭程度反映了对持水力的影响程度，越陡，说明影响越大；而等高线反映了各因素交互作用的大小，椭圆形表示作用显著[19]。结果如图3所示。

图3 菌比例和发酵温度交互影响持水力的曲面图和等高线

由图3分析可知，根据持水力得出的美国灵芝姬松茸复合酸奶的最佳加工工艺为：菌比例（美国灵芝：姬松茸）=229∶200、菌种总添加量为 5.197%、发酵温度为43.077℃、发酵时间为6.732 h，此时预测持水力为0.880。

2.2.3 响应面优化试验对酸度的影响

2.2.3.1 响应面优化试验设计与酸度结果

根据单因素试验结果，确定菌比例、总添加量、发酵时间、发酵温度为试验因素。根据Box-Beheken试验设计水平方案（表1），采用四因素三水平响应面分析，结果见表11。

表11 响应面优化试验设计对酸度结果

2.2.3.2 酸度模型检验

采用Design-Expert 12软件对于表进行多项拟合回归，得到酸度Y3与A菌比例、B菌总添加量、C发酵温度、D发酵时间的二元多次回归模型为Y3=94.92+3.50A+0.3722B-1.03C+3.41D+0.7769AB-0.8664AC+3.42AD+0.5462BC-0.2859BD-2.05CD-7.29A2-5.27B2-0.1911C2-0.3855D2

Box-Beheken试验结果方差分析见表12。

表12 酸度Box-Beheken试验结果方差分析

由表12可知交互项 （AD）对酸奶酸度较为显著，且模型显著，说明其与实际情况具有较高的吻合度，失拟项差异不显著，说明方程可以更好地用于美国灵芝姬松茸复合酸奶工艺的优化。

为验证方差分析结果，对交互项（AD）显著的曲面图和等高线图进行分析，曲面的陡峭程度反映对酸度的影响程度，越陡，说明影响越大；而等高线反映了各因素交互作用的大小，椭圆表示作用显著[19]。结果如图4所示。

图4 菌比例和发酵时间交互影响酸度的曲面图和等高线

由图4分析可知，根据酸度得出的美国灵芝姬松茸复合酸奶的最佳加工工艺为：菌比例 （美国灵芝：姬松茸）=329：250、菌种总添加量为 5.405%、发酵温度为42.706℃、发酵时间为6.617 h。此时预测酸度为93.02。

2.2.4 结果综合分析

根据感官评定优化试验得出的美国灵芝姬松茸复合酸奶的最佳加工工艺为：菌比例（美国灵芝∶姬松茸）=226∶200、菌种总添加量为 4.779%、发酵温度为42.998℃、发酵时间为7.358 h；根据持水力优化试验得出的美国灵芝姬松茸复合酸奶的最佳加工工艺为：菌比例（美国灵芝∶姬松茸）=229∶200、菌种总添加量为5.197%、发酵温度为43.077℃、发酵时间为6.732 h；根据酸度优化试验得出的美国灵芝姬松茸复合酸奶的最佳加工工艺为：菌比例（美国灵芝∶姬松茸）=329：250、菌种总添加量为5.405%、发酵温度为42.706℃、发酵时间为6.617 h。为了试验的可操作性，将美国灵芝姬松茸复合酸奶的最佳加工工艺调整为：菌比例（美国灵芝∶姬松茸）=1∶1、菌种总添加量为5%、发酵温度为43℃、发酵时间为7 h。

2.3 验证试验

根据响应面试验结果，将美国灵芝姬松茸复合酸奶的最佳加工工艺调整为：菌比例（美国灵芝∶姬松茸）=1∶1、菌种总添加量为5%、发酵温度为43℃、发酵时间为7 h。预测美国灵芝姬松茸复合酸奶的感官评分为89.742、持水力为0.880、酸度为93.020。进行三次重复试验，得到的最终感官评定为90.275、持水力为0.8762、酸度为95.5944，与预测值接近，说明响应面法优化得到的美国灵芝姬松茸复合酸奶的最佳加工工艺是合理的。

2.4 成品比较

最终，我们按照最佳加工工艺制作成品美国灵芝姬松茸复合酸奶及其空白对照酸奶。采用CAT试剂盒对其蛋白质含量进行测定，测定美国灵芝姬松茸复合酸奶CAT活力为18.652 U/mg prot，空白对照酸奶CAT活力为0.8814 U/mg prot。结果表明：随着美国灵芝、姬松茸菌丝的加入，对酸奶蛋白质含量有着显著提高。

3 结论

通过单因素试验和响应面优化试验表明，美国灵芝姬松茸复合酸奶的最佳加工工艺为：菌比例（美国灵芝∶姬松茸）=1∶1、菌种总添加量为 5%、发酵温度为43℃、发酵时间为7 h。在此工艺条件下美国灵芝姬松茸复合酸奶外观细腻，风味醇厚，无乳清析出。同时，持水力较高，蛋白凝胶网络对水的保持能力强。美国灵芝姬松茸复合酸奶凭借其独特的风味和较高的蛋白质含量有着良好的市场前景。