艾叶提取物对万古霉素诱导急性肾损伤的保护作用及其机制

李 达，李 敏，蔡文志，柳文媛，徐 健，杨宝卫*，冯 锋，**

（1江苏食品药品职业技术学院制药工程学院,淮安 223003；2常州市妇幼保健院，常州医学中心，南京医科大学，常州 213000；3中国药科大学药学院,南京 210009；3中国药科大学中药学院,南京211198）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是指不超过3 个月的肾脏功能或结构方面的异常，包括血、尿、肾脏病理组织学检测或影像方面的肾损伤标志物异常，并以肾功能迅速下降为临床特点，最终可能导致急性肾衰竭（acute renal failure，ARF）［1-2］。AKI 对人的肾脏、脑、肝等器官都有一定的危害，研究表明，患有晚期肿瘤的患者使用化疗药物导致AKI 的概率远高于早期患者，发生率约41%。因此，化疗药物在延长肿瘤患者的生命的同时，也给患者带来了严重的并发症，已成公众健康难题［3］。

当前，临床上用于治疗AKI 的药物几乎没有。常采用血液净化和特殊的中成药进行辅助治疗（中成药常用冬虫夏草或灵芝，价格高昂）［4］，给患者造成了沉重的心理负担和经济压力。因此，寻找并发现能够用于预防和治疗由化疗药物导致AKI的候选药物十分迫切。

不同病因所致AKI 的作用机制有所不同，但主要涉及血流动力学改变等几个主要病理环节，其中炎症反应、氧化应激、细胞凋亡是药物诱导AKI 发生的重要机制［6-7］。艾叶是菊科植物艾草（Artemisia argyiLevl.et Vant.）干燥叶，药食两用植物，味苦、性温，具有理气血、温经脉的功效，主要化学成分包括绿原酸类、挥发油类、黄酮类等；现代药理学证明艾叶具有抗氧化、抗炎、降血糖、免疫调节等药理作用［8-10］。

本课题组前期实验研究发现，艾叶中的黄酮、绿原酸、酚酸、酚醛、蒽醌等化合物均具有较强的抗氧化活性，艾叶石油醚萃取部位的挥发油组分具有低毒、高效的抗炎作用，所以采用艾叶治疗AKI 有理论可循。目前对艾叶是否对化疗药物导致的AKI具有保护作用未见文献报道。

本研究通过ip 雄性ICR 小鼠万古霉素（VAN）建立药物性AKI 模型，并检测小鼠肾功能、氧化应激和炎症等相关指标、检查肾脏组织形态和肾组织细胞凋亡相关基因含量水平，从而进一步阐明艾叶乙醇提取物改善AKI 的作用机制，为中药艾叶改善VAN诱导AKI作用研究提供理论依据。

1 材 料

1.1 试剂与药材

注射用VAN（浙江海正药业股份有限公司）；小鼠胱抑素C（Cys C）、尿素氮（BUN）、炎症指标肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、超敏C-反应蛋白（hs-CRP）检测试剂盒（上海沪震生物科技有限公司）；肌酐（Scr）的含量水平，氧化应激指标丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒（北京九强生物技术股份有限公司）；细胞凋亡相关基因（Bax、Bcl-2、Caspase-3）检测试剂盒（上海晶抗生物工程有限公司）；所使用的试剂均为分析纯（南京化学试剂公司）。

艾叶由湖北蕲春栽培和购买（批号180401），经冯锋教授鉴定为Artemisia argyi的干燥叶，保存于江苏食品药品职业技术学院制药工程学院中药提取实验室。

1.2 仪 器

台式高速冷冻离心机（HR/T16M，湖南赫西仪器装备有限公司）；CAX-370 型离心机（日本Tomy Seiko 公司）；酶标仪（美国BioTek EL-x800）；病理彩色图象分析系统（郑州泽铭科技有限公司）；XD-202型倒置显微镜（南京江南永新光学有限公司）。

1.3 动 物

动物等级均为SPF 级雄性ICR 小鼠，体重控制在22~25 g（南京市青龙山动物繁殖场，许可证号SCXK（苏）2020.0001），动物实验符合伦理学。

2 方 法

2.1 艾叶提取物制备

取艾叶500 g 阴干，使用95%乙醇为提取溶剂（料液比为1∶10），于室温下过夜浸泡12 h，50 ℃加热回流提取3次，每次3 h，合并提取液，过滤，减压回收溶剂，得艾叶乙醇提取物。.

2.2 动物分组、AKI模型建立与给药

小鼠适应性喂养后，随机分为空白组、模型组和给药组，给药组包括高剂量组（H 组）、中剂量组（M 组）和低剂量组（L 组）。每组6 只小鼠，实验前将小鼠用硝酸银溶液进行分组标号，且不禁水不禁食。以腹腔注射（ip）方式给药，其中，空白组小鼠按其体重给予等量的无菌生理盐水；模型组小鼠ip VAN（100 mg/kg），每日1 次，连续8 d，在此期间动物自由饮食饮水。

通过预实验发现，当给药组小鼠灌胃（ig）250 mg/kg 及其以上剂量的艾叶乙醇提取物时，小鼠出现死亡，当ig 30 mg/kg 及其以下剂量的艾叶乙醇提取物时，给药组小鼠相关参数水平与模型组无显著差异，因此，实验最终选择200 mg/kg，100 mg/kg，50 mg/kg 3 个给药剂量组。小鼠提前ig规定剂量的艾叶乙醇提取物，每日1次，连续两周，之后ip VAN（100 mg/kg），每日1 次，连续8 d，同时继续ig 规定剂量的艾叶乙醇提取物，其间动物自由饮食饮水［11］。

2.3 指标检测

2.3.1 肾功能指标Cys C、BUN、Scr 的含量测定［11］空白组、模型组、H 组、M 组、L 组实验小鼠末次给药24 h 后，均采用小鼠眼球采血法，以6 000 r/min，离心10 min，分离血清，依据试剂盒方法检测血清中有关肾功能指标的Cys C、BUN、Scr含量水平。

2.3.2 氧化应激指标MDA、SOD 和GSH-Px 的含量测定[12-13]空白组、模型组、H 组、M 组、L 组实验小鼠末次给药24 h 后，均采用小鼠眼球采血法，以6 000 r/min，离心10 min，分离血清，依据试剂盒方法检测血清中氧化应激指标的MDA、SOD 和GSHPx含量水平。

2.3.3 炎症指标TNF-α、IL-1β 和hs-CRP 含量测定[14-15]空白组、模型组、H 组、M 组、L 组实验小鼠末次给药24 h 后，均采用对小鼠眼球采血法，以6 000 r/min，离心10 min，分离血清，依据试剂盒方法检测血清中炎症指标的TNF-α、IL-1β 和hs-CRP的浓度。

2.4 标本采集与肾脏组织形态检查

分别处死小鼠并解剖取出肾脏，分成两部分，一部分于-80 ℃条件下保存，做肾组织中细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3 的检测；另一部分于10%福尔马林中浸泡24 h，然后使用乙醇脱水，切制成4 μm 厚的切片，并用做苏木精-伊红染色法（HE 染色）染色，在光镜下观察各组肾脏组织形态学改变［16］。

2.5 细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3 的检测

2.5.1 肾组织匀浆制备 将各组实验小鼠肾脏，依照质量体积比1∶9 分别加入匀浆介质，4 ℃的条件下制备肾组织匀浆，以6 000 r/min，离心10 min，分离并吸取上清液。

2.5.2 细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3含量水平的检测 于96 孔板待测孔（空白孔、标准品孔、样品孔）中加入各自样品10 μL 和稀释液40 μL；然后，标准品孔和样本孔中加入检测抗体100 μL，空白孔加入等量稀释液，避光封住，恒温37 ℃反应60 min 后弃去液体，拍干，加洗涤液，来回洗5 次，每次中间静置2 min；最后，加入底物50 μL，37 ℃恒温下放置20 min 后加终止液50 μL，于酶标仪450 nm 处测定吸收度，依照标准曲线法计算各样品浓度［17］。

2.6 统计分析

实验结果以±s表示，用SPSS 19.0软件进行统计。数据间差异性采用t检验方法，P＜0.05 表示有统计学差异。

3 结 果

3.1 艾叶乙醇提取物制备

照“2.1”项下方法，减压回收溶剂，烘箱加热烘干，得艾叶乙醇提取物浸膏52.3 g。通过计算，艾叶出膏率结果为10.46%（出膏率=浸膏质量/艾叶干重× 100%）。同时，精密称取浸膏样品20 g，加入羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液100 mL 作样品溶剂，超声溶解配制成20 g/mL 动物实验给药样品母液。

3.2 生化指标的测定

3.2.1 肾功能指标Cys C、BUN、Scr 的含量比较研究结果显示（表1），与空白组比较，模型组小鼠血中Cys C、Scr 和BUN 等反映肾功能的指标参数水平显著升高（P＜0.05），表明注射VAN 的小鼠因产生了明显的药物性AKI 模型；同时，给予了不同剂量艾叶提取物后，与模型组比较，H 组小鼠血中肾功能指标含量水平均有不同程度降低（P＜0.05），M 组和L 组给药组小鼠血中肾功能指标含量水平也有不同程度降低，且3个不同剂量对其影响呈现浓度依赖性。上述结果表明，艾叶乙醇提取物对化疗药物VAN 诱导的药物性AKI 具有保护作用。

Table 1 Content of Cys C,BUN and Scr in different groups(± s,n = 6)

Table 1 Content of Cys C,BUN and Scr in different groups(± s,n = 6)

Cys C: Cystain C; BUN: Blood urea nitrogen; Scr: Serum creatinine; L group: Low-dose(50 mg/kg) group; M group: Middle-dose(100 mg/kg)group;H group:High-dose(200 mg/kg)group#P ＜0.05 vs blank group;*P ＜0.05 vs model group

Group Blank Model L group M group H group Cys C/(mg/L)0.38±0.03 0.68±0.13#0.55±0.17 0.53±0.12 0.50±0.14*BUN/(mmol/L)8.26±1.09 11.26±2.11#11.16±3.46 10.02±0.97 9.30±1.90*Scr/(μmol/L)77.06±15.26 119.33±10.36#112.80±15.73 110.59±6.50 102.36±7.75*

3.2.2 氧化应激指标MDA、SOD 和GSH-Px 含量比较 研究结果显示（表2），与空白组比较，模型组小鼠血清中MDA 含量增加，SOD 和GSH-Px活力下降，且反映氧化应激上述指标参数水平均呈显著性变化（P ＜0.05），表明本实验注射VAN 模型小鼠出现明显的氧化应激反应；同时，给予了不同剂量艾叶提取物后，与模型组比较，H 组小鼠血中氧化应激指标参数含量水平均有不同程度降低（P＜0.05），M 组和L 组小鼠血中肾功能指标含量水平也有不同程度降低，且3个不同剂量对其影响呈现浓度依赖性。上述结果表明，艾叶提取物可能通过抗氧化应激改善化疗药物VAN引起的AKI。

3.2.3 炎症指标TNF-α、IL-1β 和hs-CRP 含量比较 研究结果显示（表3），与空白组比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-1β 和hs-CRP 含量均有增加，且TNF-α 和IL-1β 参数水平呈显著性变化（P＜0.05），表明本实验注射VAN 模型小鼠出现明显的炎症反应；同时，给予了不同剂量艾叶提取物后，与模型组比较，H 组、M 组和L 组给药组小鼠血中肾功能指标含量水平也有不同程度降低，且3个不同剂量对其影响呈现浓度依赖性。上述结果表明，艾叶提取物可能通过抑制炎症反应改善化疗药物VAN引起的AKI。

Table 2 Content of MDA, SOD and GSH-Px in different groups (xˉ±s,n = 6)

Table 3 Content of TNF-α,IL-1β and hs-CRP in different groups(xˉ±s,n = 6)

3.2.4 肾脏组织形态学改变 研究结果（图1）显示，在光镜下，发现空白组小鼠的肾小管、肾小球等结构颜色正常、形态正常，无明显的异样；与空白组比较，模型组小鼠肾小管结构出现了异样的病理情况，较多肾小管上皮细胞水肿甚至坏死，无明显的细胞界限，小管管腔内有大量细胞管型，间质明显淤血；与模型组比较，给药组H 组、M 组和L组的小鼠肾脏的肾小管、肾小球病理症状随着给药量的增加，给药组小鼠肾脏组织病变减轻程度呈现浓度依赖性。

3.3 细胞凋亡指 标Bax、Bcl-2 和Caspase-3 含量比较

研究结果显示（表4），与空白组比较，模型组小鼠模型组Bax 含量升高、Bcl-2 含量降低，Cas‑pase-3 含量升高，且反映细胞凋亡指标的Bcl-2、Caspase-3 参数水平呈显著性变化（P＜0.05）。同时，给予了不同剂量艾叶提取物后，与模型组比较，H 组、M 组和L组给药组不同程度地降低了Bax浓度、升高了Bcl-2 浓度和降低了Caspase-3 浓度，其中H组小鼠Bax、Caspase-3等参数水平均有发生显著性差异（P＜0.05）且3 个不同剂量对其影响呈现浓度依赖性；此外，Bax/Bcl-2 比例下降，从而减少了Caspase-3的产生，起到抑制细胞凋亡作用。上述结果表明，艾叶提取物可能通过抑制细胞凋亡改善化疗药物VAN引起的AKI。

Figure 1 Pathological changes in different groups

Table 4 Content of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in different groups (xˉ±s,n = 6)

4 讨 论

本实验结果表明，艾叶乙醇提取物对化疗药物VAN 诱导的AKI 具有保护作用，其机制与艾叶提取物能改善氧化应激、抑制炎症与细胞凋亡等有关，与Xu，Lu 等的研究结果［14，18］一致。此外，本实验的研究结果进一步证实了氧化应激、炎症反应、细胞凋亡3 个影响因素在VAN 诱导的药物性AKI模型中过程中关系密切且相互影响。

艾叶在我国药用历史悠久，且资源丰富，目前临床应用多是胃炎、关节炎等疾病治疗［19］，尚未见到AKI临床治疗的相关文献记载；而Zhang 等［20］的研究表明，艾叶水煎液对尿毒症患者慢性肾功能不全有保护作用，且该作用在一定浓度范围内呈现剂量相关性，表明艾叶临床上具有潜在的肾保护作用。根据Li 等［21］的研究，艾叶的口服给药的安全性较好，小鼠的给药量到达120 g/（kg·d）灌胃7 d时仍未出现明显急性毒性反应。本实验设计的对治疗组小鼠采用8 d 灌胃艾叶提取物［200 mg/（kg·d）］的给药方式，该剂量给药期间小鼠无明显不良反应，治疗组小鼠相比模型组小鼠肾功能明显改善，表明其具有潜在的临床使用安全疗效。

艾叶中的化学成分繁多，且化合物之间的协同作用对药效影响甚大，需要进一步对其含有单体化学成分的AKI 药效和机制深入研究，为艾叶防治AKI的潜在药物开发奠定实验基础。