2种常见CRISPR-Cas系统在苹果中的适用性特征

岳鹏 高海琴 李哲 米志波 郑博 赵彦敏

摘要：运用生物信息学方法初步分析CRISPR-Cas9和Cpf1在苹果中的整体适用性特征，以期为苹果基因组编辑和CRISPR-Cas在苹果研究中的推广使用提供一定的参考和便利。结果表明，苹果染色体中有数量可观的PAM，平均间隔7 bp碱基有1个5′-NGG、间隔3 bp有1个5′-TTN;也就是说5′-TTN比5′-NGG的出现频率高。SpCas9、FnCpf1分别有29.0%、26.9%的作用位点几乎覆盖了所有染色体基因，个别不能被SpCas9识别的基因能被FnCpf1识别，反之亦然。苹果的CRISPR靶序列有大量重复，单一靶序列被视为能被Cas蛋白特异识别并有效编辑。在靶序列长度为20 nt时，99.5%的染色体基因可至少被其中1种Cas蛋白编辑，分别具有不同的可编辑度搭配;其中的237个基因只能被1种Cas蛋白编辑，填补了另一种Cas蛋白留下的编辑空白，另有220个染色体基因（0.5%）不能被任一种Cas蛋白编辑，即2种Cas蛋白同时留下编辑空白，没有互补。

关键词：苹果;CRISPR-Cas;适用性特征;PAM出现频率;基因编辑

中图分类号：S661.101   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）07-0043-08

收稿日期：2021-06-04

基金项目：中国成人教育协会“十四五”成人继续教育科研规划重点课题（编号：2021-323ZB）;河北省张家口市科技项目（编号：18110300043）;河北省张家口市社会科学立项研究课题（编号：2021121）。

作者简介：岳 鹏（1984—），男，河北张家口人，硕士，讲师，从事农林生命科学类和开放教育研究。E-mail：yppolymerase@foxmail.com。

通信作者：赵彦敏，博士，副教授，从事农林生命科学类和开放教育研究。E-mail：zym319@163.com。

苹果（ Malus domestica ）是世界上主要果树作物之一，其产量和质量易受生物和非生物胁迫的影响[1]。因此，了解抗逆性相关基因的功能及调控规律，对培育抗逆性强的品种至关重要[2]。与其他作物相比，果树具有高度杂合的多倍体基因组且繁育周期长，导致传统的育种研究进展缓慢[3];而随着基因组测序工作的完成，对其基因结构、基因通路和基因功能的认识为基因编辑奠定了基础[4]。高效、易用、省时、低成本的基因编辑技术是赋予果树重要经济性状的捷径。常间四文重复序列丛集关联蛋白[CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）-Cas（CRISPR-associated proteins）]系统具备以上优势，在研究生物多种类的精确分子机制方面具有极高的应用价值[5]。

当前，基因组编辑技术主要集中在第2类CRISPR-Cas系统[6];它可以使用单个效应蛋白剪切DNA，包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型[7]。其中，Ⅱ型的Cas9及其失去剪切活性的衍生品dCas9被广泛应用于多种生物体的基因组操作，包括靶向基因干扰、转录激活抑制、表观遗传修饰及目标碱基对转换[8-9]。经典的Cas9蛋白须识别衔接在靶序列（+）3′端形如5′-NGG 的前间隔序列邻近基序（protospacer-adjacent motif，PAM，+），并在PAM上游第3个碱基处切割双链，形成平头末端;在人类基因组中约平均间隔8 bp就会有1个5′-NGG[10]。不同于此，Ⅴ型的Cpf1（Cas12a）要识别毗邻在靶序列（+）5′端形似5′-TTN 的PAM（+），并在PAM下游的同向链（+）第18、互补链（-）第23碱基处交错切割，形成有5个突出碱基的黏性末端[11]。作为新型且更小的CRISPR效应蛋白，Cpf1的开发利用有利于突破和克服Cas9在使用中的一些限制，尤其是拓宽了CRISPR-Cas系统的识别范围，使之能更有效地编辑富含AT碱基的基因组[12]。

CRISPR-Cas9已被大量使用在植物基因功能分析及育種研究中[13-15]，其中包括多种果树[14]。有关苹果的几项研究，依次是首次利用CRISPR-Cas9敲除内源 PDS （phytoene desaturase）基因[16]，高效传送CRISPR-Cas9核糖核蛋白到苹果原生质体操纵DIPM1（ DspA/E -interacting proteins of  M.×domestica ）、DIPM2和DIPM4基因[17]，优化CRISPR-Cas9的应用条件并敲除PDS和TFL1（terminal flower）基因[3]，运用CRISPR-Cas9敲除DIPM4基因的同时又减少外源DNA的残留[18]。相对地，CRISPR-Cpf1的技术特点更加鲜明，但在2016年首次应用于水稻和烟草后[19]，在植物基因组项目中使用的报道较少，目前还未见于果树研究[2]。

已有的研究结果表明，CRISPR-Cas系统可实际应用于苹果基因编辑，但只关注了少数几个基因，且仅限于使用CRISPR-Cas9。本研究对苹果全基因组序列进行初步分析，尝试探索2种流行的CRISPR-Cas系统，即CRISPR-Cas9和CRISPR-Cpf1，在苹果基因组编辑中的整体适用性，首次从PAM的数量和频率、靶序列的重复和分布及2种Cas蛋白的互补等几个方面开展讨论，并形成PAM位点和靶序列信息库，以期为苹果基因组编辑和CRISPR-Cas系统在苹果研究中的推广使用提供一定的参考和便利。

1 材料与方法

1.1 数据获取

苹果全基因组代表性数据ASM211411v1下载自NCBI网站[20]，17条染色体（chromosome，chr）和1条线粒体（mitochondrion，mt）的DNA序列以FASTA格式分别存储在文本文件中;所有下载的DNA都只有单链（+）。相应的基因文件也从NCBI网站下载，其中以列表形式记录基因在DNA序列上的起止位点等信息。最新发布在NCBI网站上的苹果基因组数据ASM411538v1质量更高[21]，但相应的基因信息不够完善，只在本研究中作对比和补充。在诸多CRISPR-Cas系统中，效应蛋白SpCas9[化脓性链球菌（ Streptococcus pyogenes ，Sp）]和FnCpf1[弗郎西斯菌（ Francisella novicida ，Fn）]识别的PAM较有代表性，分别为5′-NGG和5′-TTN[10-11];本研究围绕这2种典型的PAM，尝试使用个人计算机分析苹果全基因组。

1.2 PAM计数和间距计算

对苹果各DNA序列出现的5′-NGG或 5′-TTN 计数，并记录中间碱基在DNA序列上的位点作为PAM位点;还需要同时累计5′-CCN或 5′-NAA，以实现对互补链的搜索。计数期间，单独计算N所代表的各种碱基占比，并用PAM位点数量与DNA长度的比值表示序列的PAM密度。除线粒体外，合计染色体DNA的各项数据以考量全基因组。

同样地，分别计算各DNA序列和全基因组的PAM出现频率。将每2个相邻PAM位点之差作为间距（用字母 d 表示），其意义为间隔 d 个碱基对存在1个PAM，代表PAM的出现频率;并累计每个 d的出现次数（用字母n表示），再把全部d升序排列（以t为排列序号），记录不同d的数量（用字母m 表示）。PAM出现频率的均值（ d  mean）和中值（ d  median）计算如下：

d  mean=∑ mi=1d in i∑mi=1n i;若∑ti=1n i≥∑mi=1n i2>∑t-1i=1n i，d  median =d t 。

1.3 计算剪切位点

在DNA序列上从5′-NGG前溯3个碱基或从5′-CCN后推3个碱基，获得Cas9剪切位点。通过判断剪切位点是否处于基因的起止位点之间，将对应的PAM位点划入相应的基因范畴;不属于任何基因范畴的PAM位点不做标记。

依据Cpf1的剪切特征，在DNA序列上从5′-TTN后推18个碱基或从5′-NAA前溯23个碱基，获得同向剪切位点，用来判断相应的PAM位点是否属于同向链基因;从5′-TTN后推23个碱基或从 5′-NAA 前溯18个碱基，获得逆向剪切位点，用来判断相应的PAM位点是否属于互补链基因。

1.4 靶序列的截取

根据2种PAM的特点，在DNA序列上分别截取长度为20 nt（不含PAM）的靶序列（target），用PAM位点命名，以FASTA格式储存;PAM在互补链上的，还需要按照碱基配对原则转换碱基并逆序。对具有同种PAM的靶序列进行重复性搜索，找到单一序列（singleton）和相同序列簇（cluster）;簇中的PAM位点有属于染色体基因的计1分，有属于染色体基因间隔的计2分，有属于线粒体基因的计4分，有属于线粒体基因间隔的计8分，4种分值任意组合可将所有簇归入15个重复类（用repeat  N 命名， N 为不大于15的正整数）。重点关注靶序列单一且属于基因范畴的PAM位点，其数量与基因长度的比值表示基因的可编辑度;按照“基因ID-PAM位点-靶序列”的模式建立简易信息库，找到可编辑度最高和最低的基因。

1.5 程序实现

以上操作已被整合到几个Perl脚本中，并尽量优化算法降低时间复杂度和空间复杂度[22]。其中，为避免耗费大量时间，在判断PAM位点是否影响基因时，用数组模拟DNA序列，数组索引表示位点，基因区间内的数组元素由基因ID填充，其他为未定义（undef）值;当剪切位点对应的数组元素为基因ID时，将PAM位点划入此基因范畴。为避免占用大量内存空间导致程序卡顿，在搜索重复靶序列时，把总文件分割成大小合适的几个子文件，使用散列快速剔除子文件内的相同序列;然后利用每个子文件中序列唯一的特点，使用散列剔除子文件间的相同序列，最终合并成没有重复序列的总文件。

2 结果与分析

2.1 PAM含量分析

苹果基因组（ASM211411v1）中5′-NGG总量为48 368 223，chr15的数量最多（4 179 083），chr01的最少（2 291 346），各染色体间差异较大;再结合序列长度估算序列的PAM密度，基因组是0.074，chr10最高（0.078），chr06最低（0.069），相差不大（表1）。在基因组中，CGG、GGG、AGG和TGG在NGG总量中的比例分别为11.9%、21.4%、30.4%、36.3%（图1-A）;在各染色体中的比例与此一致，略有微小波动（表1）。线粒体中的5′-NGG含量为 46 468，但密度达到0.117，高于基因组最高值;CGG、GGG、AGG和TGG的比例分别为19.2%、259%、30.2%、24.7%，与基因组中的同项数据也有明显差异（图1-B）。

基因组中5′-TTN的总数为127 635 154，同样是chr15最多（11 092 974），chr01最少（5 902 134）;估算基因组的密度是0.194，依然是chr10最高（0206），chr06最低（0.180），两者比较接近（表2）。在基因组中，TTC、TTA、TTG和TTT在TTN总量中的比例分别为19.6%、21.2%、22.2%、37.0%（图1-C）;同样，在各染色体中的比例与此一致（表2）。线粒体中5′-TTN含量为69 296，密度只有0.174 6，低于基因组最低值;TTC、TTA、TTG和TTT的比例分别为28.4%、18.7%、20.7%、32.2%，与基因组中的同項数据也差异明显（图1-D）。

作为对比，另一基因组数据（ASM411538v1）的5′-NGG密度为0.084，CGG、GGG、AGG和TGG的比例分别为11.7%、21.5%、30.6%、36.3%;5′-TTN的密度为0.219，TTC、TTA、TTG和TTT的比例分别是19.6%、21.2%、22.4%、36.8%。使用2个不同版本的基因组数据计算出的结果很接近，特别是NGG和 TTN的构成比例几乎完全一致，可以用同一组饼状图表示（图1-A、图1-C）。

2.2 PAM出现频率

在苹果基因组（ASM211411v1）中，相邻5′-NGG的间距最小为1 bp，出现次数最多（图2-A）;最大为1 347 bp，出现在chr07的19 065 740～19 067 087位点间（表1）。间距中值是7 bp，表示平均约间隔7 bp碱基就有1个5′-NGG，也说明半数以上的间距不大于7 bp;间距均值为12.0 bp，是受到最大值的影响而产生了偏移（图2-a）。各染色体情况与此高度一致（表1）。而在线粒体中，间距中值和均值分别为5、8.5 bp，与基因组完全不同（图2-b）。

基因组中，相邻5′-TTN的间距最小为1 bp，出现次数最多（图2-c）;最大为1 022 bp，出现在chr07的26 831 153～26 832 175位点间（表2）。间距中值是3 bp，表示平均约间隔3 bp碱基就有1个 5′-TTN，也说明半数以上的间距不大于3 bp;受最大值影响，间距均值是4.5 bp（图2-c）。同样，各染色体情况与此一致（表2）。线粒体的间距中值和均值分别为4、5.7 bp，也与基因组完全不同（图2-d）。使用另一版本的基因组数据（ASM411538v1）计算，可得出类似的结果：5′-NGG的间距中值和均值分别为7、11.9 bp，5′-TTN的间距中值和均值分别为3、4.5 bp;所展示出的变化趋势也可以绘成同样的图像（图2-a、图2-c）。

2.3 PAM的基因归属

在苹果基因组中，29.0%的5′-NGG和26.9%的5′-TTN能影响到基因，基本覆盖了全部43 464个基因（表3）。其中，chr06上ID為114825448的基因含5′-NGG最多，有14 620个;chr16的114822391（表示基因ID，下同）和chr09的114827208基因不含5′-NGG。chr06的114825448基因含5′-TTN最多，有36 069个;chr16的108169786、chr12的108174957、chr11的108174696、chr02的114823832、chr03的114824289和108171505基因都不含5′-TTN。

在线粒体中，15.6%的5′-NGG能作用于全部70个基因，13.5%的5′-TTN覆盖了98.6%的基因（表3）。其中，ID为13630194的基因含5′-NGG最多，有1 186个;13630239（121 892～121 913位点）和13630229基因含5′-NGG最少，只有5个。13630194基因含5′-TTN最多，有1 337个;13630239基因（121 892～121 913位点）不含5′-TTN。与各染色体相比，线粒体中属于基因间隔的PAM占比明显更大（表3）。

2.4 靶序列的重复簇

苹果的CRISPR靶序列有大量重复，共计15种重复簇（表4）。其中，重复序列只属于染色体基因的簇划入repeat1，只属于染色体基因间隔的为repeat2，只属于线粒体基因的为repeat4，只属于线粒体基因间隔的为repeat8，repeat15是重复的靶序列同时出现在上述4个区域中。可以发现，带有 5′-NGG 的靶序列，染色体基因的648条与线粒体基因中的620条重复;带有5′-TTN的靶序列，染色体基因中的1 038条与线粒体基因中的966条重复（表4，repeat5、7、13、15）。只属于染色体基因的，带有5′-NGG的重复靶序列共有3 883 583条，带有5′-TTN的重复靶序列共有84 71 496条（表4，repeat1、3、5、9、7、11、13、15括号中的数字）;而在线粒体基因中，这2个数值分别为980、1 087（表4，repeat4、5、6、12、7、13、14、15括号中的数字）。

2.5 基因可编辑度

在苹果各染色体中，带有5′-NGG的单一靶序列数量为26 778 571，其中属于基因的有9 436 659，其余都处于基因间隔中;带有5′-TTN的单一靶序列数量为73 337 956，属于基因的有240 838 78（表4）。SpCas9对chr04上的103432805基因有最高的可编辑度，为0.226，含有PAM最多的114825448基因的可编辑度仅为0.020（图3）;另有372个基因的可编辑度为0。FnCpf1对chr08上的114826681基因有最高的可编辑度，为0.344，含有PAM最多的114825448基因的可编辑度仅为0.049（图3）;另有305个基因的可编辑度为0。

在线粒体中，带有5′-NGG的单一靶序列数量为34 535，属于基因的有4 344;带有5′-TTN的单一靶序列数量为49 191，属于基因的有5 220（表4）。SpCas9对13630239基因（121892～121913位点）可能有最高的可编辑度，为0.227，含有PAM最多的13630194基因的可编辑度为0.092（图3）;有4个基因的可编辑度为0。FnCpf1对13630216基因可能有最高的可编辑度，为0.224，含有PAM最多的13630194基因的可编辑度为0.095（图3）;有6个基因的可编辑度为0。

2.6 Cas蛋白的编辑互补

苹果中的大多数基因可同时被2种Cas蛋白编辑， 分别具有不同的可编辑度搭配（图3）。 可编辑度为0的基因在全部基因中的占比较小，在各DNA序列上均有分布;其中，chr04上的数量最多，有66个不能被SpCas9编辑、有62个基因不能被FnCpf1编辑（图4）。经过筛选，共有237个（0.5%）染色体基因、2个（2.9%）线粒体基因能被1种Cas蛋白编辑，填补了另一种Cas蛋白留下的编辑空白（图4，part Ⅰ、part Ⅲ）;共有220个染色体基因（0.5%）、4个（5.7%）线粒体基因不能被任一种Cas蛋白编辑，即2种Cas蛋白同时留下编辑空白，没有互补（图4，part Ⅱ）。

3 讨论

作为重要的基因编辑工具[23]，CRISPR-Cas系统在苹果基因组中有较好的整体适用性，主要表现在3个方面。一是有数量可观的PAM分散在苹果DNA序列的各个角落，出现频率很高，平均间隔很短。二是Cas蛋白的作用位点几乎覆盖了所有基因，个别不能被SpCas9识别的基因却含有FnCpf1的识别位点，反之亦然。三是拥有单一靶序列的基因占大多数，99.5%的染色体基因和94.3%的线粒体基因都能至少被其中1种Cas蛋白编辑。苹果DNA序列的测序结果表明，AT碱基的含量高于CG碱基[20-21]，导致5′-TTN的数量远超5′-NGG、5′-TTN 的出现频率更高、带有5′-TTN的单一靶序列数量更多，也就是说Cpf1在苹果基因编辑中有更大的可挖掘潜力。

各染色體的PAM密度、组成和出现频率几乎一致，可视作苹果基因组的整体特征之一。虽然也存在于苹果细胞中，但线粒体通常被认为是有益的共生生物[24]，其DNA不被计入基因组;这一点在本研究中也有突出体现，即与染色体的同项数据相比，线粒体都有明显差异。目前，对苹果线粒体基因的编辑还未见报道，其操作过程是否与基因组相同还需要更深入的研究验证，在本研究中仅是预测性的初步探讨;且线粒体DNA体量小、基因少[20]，对基因组编辑的影响不大，在特定环境中可不做考虑。叶绿体也有类似情况[25]，可在条件成熟时进一步研究讨论。

已有的测序结果含有未知碱基，在数亿碱基的苹果DNA序列中比例微小，对多项计算结果的影响可忽略不计[20-21]。但如果2个PAM之间存在未知碱基且结合上下游无法判断是否存在另一个PAM，就在确定PAM频率时摒弃这2个PAM的间距，避免出现超长间距的同时，也保证了是在计算相邻2个PAM的间距。对比人类基因组取间距中值作为PAM的出现频率，本研究也采用了同样的取值方法;苹果基因组平均间隔7 bp碱基就有1个5′-NGG，频率高于人类基因组的8 bp[10]。

一般，判断PAM是否属于基因依据的是其位点是否在基因起止位点间，临近基因边缘的PAM就有可能实际作用到了间隔区。不同于此，本研究将判断依据改进为剪切位点是否在基因起止位点间，既避免了上述问题，也充分挖掘了隐藏的基因PAM。在此基础上截取的靶序列都具有明确的基因归属。靶序列的长度按常规被设定为20 nt，初步分析了因序列重复导致的脱靶情况;根据序列越短重复率越高的共识，可适当增加靶序列的长度提高基因的可编辑度。此外，脱靶的原因还包括相似匹配和种子序列的长度[11]，可在未来的研究中做更深入的分析。

基因可编辑度与单一靶序列的数量成正比，与基因自身的长度成反比，表示的是单位长度内含有的备选靶序列密度。可编辑度为0的基因，小部分是因为不含有PAM，大多数是在屏蔽了重复靶序列后，备选数量为0。本研究采用了较严格的屏蔽标准，凡是在苹果DNA序列中出现的重复靶序列均计入重复簇;重复簇的类别划分较细，15个类别涵盖了靶序列所在4个区域的所有搭配，方便在试验设计时有侧重地取舍。在苹果全部基因中，2种Cas蛋白都有占比很小的编辑盲区，FnCpf1要好于SpCas9。盲区重叠的部分所含的224个基因不适宜使用这2种Cas蛋白编辑，可考虑换用识别不同PAM的其他Cas蛋白;其中超过半数的基因（139个）编码多种RNA，通常在实际研究中较少涉及到。

在Perl脚本的帮助下，各步骤的运算结果都在文本文件中详细列表构成了信息库，可直接打开查询感兴趣的信息;也可导入数据库加以专业化的管理和维护，成为网络服务平台的构建基础，这是开展下一步研究的一个重要方向。

参考文献：

[1]Arzani A，Ashraf M. Smart engineering of genetic resources for enhanced salinity tolerance in crop plants[J]. Critical Reviews in Plant Sciences，2016，35（3）：146-189.

[2]Wang X H，Tu M X，Li Z，et al. Current progress and future prospects for the clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR） genome editing technology in fruit tree breeding[J]. Critical Reviews in Plant Sciences，2018，37（4）：233-258.

[3]Charrier A，Vergne E，Dousset N，et al. Efficient targeted mutagenesis in apple and first time edition of pear using the CRISPR-Cas9 system[J]. Frontiers in Plant Science，2019，10：40.

[4]Zhou J H，Li D D，Wang G M，et al. Application and future perspective of CRISPR/Cas9 genome editing in fruit crops[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2020，62（3）：269-286.

[5]Yan F C，Wang W，Zhang J Q. CRISPR-Cas12 and Cas13：the lesser known siblings of CRISPR-Cas9[J]. Cell Biology and Toxicology，2019，35（6）：489-492.

[6]Strecker J，Jones S，Koopal B，et al. Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing[J]. Nature Communications，2019，10：212.

[7]Makarova K S，Zhang F，Koonin E V. Snapshot：class 2 CRISPR-Cas systems[J]. Cell，2017，168（1/2）：328-328e1.

[8]Hu J H，Miller S M，Geurts M H，et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity[J]. Nature，2018，556（7699）：57-63.

[9]Moradpour M，Abdulah S N A. CRISPR/dCas9 platforms in plants：strategies and applications beyond genome editing[J]. Plant Biotechnology Journal，2020，18（1）：32-44.

[10]Hsu P D，Lander E S，Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering[J]. Cell，2014，157（6）：1262-1278.

[11]Zetsche B，Gootenberg J S，Abudayyeh O O，et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system[J]. Cell，2015，163（3）：759-771.

[12]楊 帆，李 寅. 新一代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1[J]. 生物工程学报，2017，33（3）：361-371.

[13]Ma X L，Zhu Q L，Chen Y L，et al. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants：developments and applications[J]. Molecular Plant，2016，9（7）：961-974.

[14]Wang X H，Tu M X，Wang D J，et al. CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis in grape in the first generation[J]. Plant Biotechnology Journal，2018，16（4）：844-855.

[15]Rodríguez-Leal D，Lemmon Z H，Man J，et al. Engineering quantitative trait variation for crop improvement by genome editing[J]. Cell，2017，171（2）：470-480，e8.

[16]Nishitani C，Hirai N，Komori S，et al. Efficient genome editing in apple using a CRISPR/Cas9 system[J]. Scientific Reports，2016，6：31481.

[17]Malnoy M，Viola R，Jung M H，et al. DNA-free genetically edited grapevine and apple protoplast using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：1904.

[18]Pompili V，Costa L D，Piazza S，et al. Reduced fire blight susceptibility in apple cultivars using a high-efficiencyCRISPR/  Cas9-FLP/FRT-based gene editing system[J]. Plant Biotechnology Journal，2020，18（3）：845-858.

[19]Endo A，Masafumi M，Kaya H，et al. Efficient targeted mutagenesis of rice and tobacco genomes using Cpf1 from  Francisella novicida [J]. Scientific Reports，2016，6：38169.

[20]Daccord N，Celton J M，Linsmith G，et al. High-quality de novo assembly of the apple genome and methylome dynamics of early fruit development[J]. Nature Genetics，2017，49（7）：1099-1106.

[21]Zhang L Y，Hu J A，Han X L，et al. A high-quality apple genome assembly reveals the association of a retrotransposon and red fruit colour[J]. Nature Communications，2019，10：1494.

[22]Alsuwaiyel M H.Algorithms：design techniques and analysis （revised edition）[M]. Singapore：World Scientific Publishing，2016：20-34.

[23]Koonin E V，Makarova K S，Zhang F. Diversity，classification and evolution of CRISPR-Cas systems[J]. Current Opinion in Microbiology，2017，37：67-78.

[24]Nykky J，Vuento M，Gilbert L.Role of mitochondria in parvovirus pathology[J]. PLoS One，2014，9（1）：e86124.

[25]Waters M T，Langdale J A.The making of a chloroplast[J]. The EMBO Journal，2009，28（19）：2861-2873.