腹腔穿刺引流术通过激活Nrf-2/HO-1通路和抑制自噬减轻大鼠重症急性胰腺炎

重症急性胰腺炎(SAP)是一种以高发病率、高致死率为特征的消化系统疾病，目前发病机制尚不明确。主流观点认为多种原因导致的胰腺自身消化可引起全身炎症反应综合征，进而诱发多器官功能衰竭，是导致患者死亡的主要原因。本课题组前期研究证实，引流SAP早期产生的胰源性腹水（PAAF）即行腹腔穿刺引流术（APD）可显著降低重症急性胰腺炎病人的全身炎症反应，对重要脏器起到保护作用。然而APD减轻胰腺损伤的具体机制目前尚不完全明了。

既往研究表明，受损的自噬介导腺泡细胞空泡化及胰蛋白酶原的激活，是导致急性胰腺炎（AP）发生与恶化的重要因素，而APD与自噬间是否存在联系尚未得到证实。核因子E2相关因子2(Nrf-2）作为内源性抗氧化通路的关键因子，通过Nrf-2/抗氧化反应元件（ARE）信号通路上调其下游的血红素合酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶的表达，在胰腺炎等炎症性疾病中发挥重要的保护作用。同时，Nrf2/HO-1通路还参与自噬调节。因此，我们推测APD可以通过激活Nrf2/HO-1通路并改善腺泡细胞的自噬活动，从而成为早期治疗SAP的重要手段。基于此，本实验拟从影响SAP大鼠腺泡细胞内自噬及Nrf-2/HO-1信号通路的角度探讨APD的治疗机制，为APD的临床应用提供证据，并为未来探索更多SAP治疗手段提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂

SPF 级8～9 周龄雄性SD 大鼠32 只，体质量210～230 g，购自成都达硕动物科技有限公司；牛磺胆酸钠、锌原卟啉（ZnPP）（Sigma-Aldrich）；TNF-α、IL-1β酶联免疫吸附检测试剂盒（江莱生物）；Trizol、全蛋白/核蛋白提取试剂盒（索莱宝）；Bradford蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）；丙二醛（MDA）测定试剂盒、总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、还原性谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒（建成生物）；兔抗大鼠HO-1、Nrf-2、p62 抗体（Cell Signaling Technology）；兔抗大鼠LC-3B抗体（Abcam）；兔抗大鼠β-actin抗体、兔抗大鼠PCNA抗体、山羊抗兔二抗（武汉三鹰）；吸入性麻醉剂异氟烷（瑞沃德）。

1.2 动物模型及制备

大鼠饲养于独立通气笼具（IVC），不限饮食，12 h/12 h昼夜循环，适应喂养1周后进行试验。将32只雄性大鼠随机分为4组：假手术组（SO组），SAP组，APD组，APD干预+HO-1特异性抑制剂组（APD+ZnPP组），每组8只。SO组为开腹后翻动胰腺数次后关腹。SAP组为使用4%牛磺胆酸钠沿胰管逆行注射法制备SAP模型。APD组处理方法参考本课题组已发表文献［10］，即SAP 建模后于右下腹放置引流管后关腹。APD+ZnPP组为建模前12 h腹腔注射ZnPP 30 mg/kg，其余操作同APD组。所有大鼠于建膜后12 h处死并收集血样、胰腺组织备用。所有实验过程均符合单位和国家有关实验动物管理和使用的规定。

1.3 动物取材方法

大鼠行异氟烷吸入麻醉后开腹，行腹主动脉采血，血样于冰上静置30 min后离心（3500 r/min，10 min），取上清液并保存于-80 ℃冰箱。行生理盐水灌洗后，沿十二指肠剪下胰腺，取5 mm×5 mm组织块放置于4%多聚甲醛中固定。剩余胰腺组织分装后使用液氮速冻，待取材完成后转移并保存于-80 ℃冰箱。

1.4 胰腺组织病理学评价

胰腺组织固定后行脱水、石蜡包埋、切片、HE 染色。于显微镜下观察胰腺组织病理变化。依据Schmidt等报道的标准，对胰腺水肿、出血、腺泡细胞坏死、炎症细胞浸润等进行评分，计算10个独立视野，取平均分作为每张切片的最终评分。

灌区内两个气象站计算得到的春玉米日需水量变化过程和高度一致。计算得到春玉米生育期内总需水量约为510 mm，该值与赵春林在充分供水条件下（灌水量261～304 mm）得到的春玉米耗水量505.5～506.2 mm一致[15]。在春玉米总需水量中，苗期、生长期、开花灌浆期和成熟期的需水量分别占总需水量的15%、38%、3%6和11%，各阶段的日需水量分别约为2.4 mm/d、3.9 mm/d、4.3 mm/d和2.3 mm/d，生育期日需水量为3.3 mm/d。可以看出，作物需水最关键的时期为开花灌浆期，其次为生长期，成熟期和苗期的日需水量较小。

下面我们以两部仙侠小说为例，探讨外译策略。《盘龙》讲述了一个拥有‘盘龙戒指’的少年踏上梦幻之旅的故事。

1.5 胰腺亚细胞结构观察

ELISA结果显示，SAP组血清中TNF-α、IL-1β水平较SO组显著提升（＜0.05），APD组炎症因子TNF-α、IL-1β水平较SAP组降低（＜0.05，图2A）。

1.6 血清淀粉酶，脂肪酶及血清炎症因子的测定

4.可实现深入校企联合，对口培养。提高学生的技能水平，夯实知识基础，增加就业竞争力。研发完成“大型养路机械3D模拟仿真培训基地”。

1.7 实时定量PCR（RT-PCR）

采用Trizol 法提取胰腺组织内总mRNA，使用NanoDrop ND-2000仪（Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA）测定每个样品的mRNA浓度及纯度，纯度以/表示，所获得的mRNA纯度均在1.9～2.0。每个样品根据浓度稀释为50µg/mL后采用一步法SYBR PrimeScript TM RT-PCR试剂盒II(Takara）通过C1000 TM Thermal Cycler(Bio-Rad）仪器进行检测。PCR条件如下：42 ℃5 min；95 ℃5 s、60 ℃30 s，进行40个循环。数据采用2法进行分析。引物序列见表1。

1.8 Western blotting

分别采用全蛋白提取试剂盒与核蛋白提取试剂盒提取胰腺组织全蛋白与核蛋白（核蛋白使用新鲜组织；全蛋白使用冻存组织），并用Bradford 法测定蛋白浓度。进行常规电泳、转膜、封闭、孵育、发光。总蛋白采用β-actin作为内参，核蛋白采用PCNA作为内参。使用Azure biosystems 300发光成像系统检测蛋白表达。

1.9 氧化应激指标测定

使用试剂盒测定胰腺组织内丙二醛(MDA)、SOD、谷胱甘肽（GSH）的活性。

1.10 统计学方法

2.2.1 对照品溶液 精密称取在五氧化二磷中干燥12 h后的米索硝唑对照品12.0 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制成米索硝唑质量浓度为0.48 mg/mL的对照品溶液。

胰腺组织透射电镜显示，SAP组腺泡细胞内出现大量酶原颗粒，伴有线粒体肿胀与内质网扩张，同时出现多量自噬小泡形成。APD组酶原颗粒较SAP组有所减少，线粒体与内质网损伤情况有所改善（图3）。

2 结果

2.1 APD对胰腺组织病理损伤及脂肪酶、淀粉酶的影响

Western blotting检测结果显示，胰腺组织内自噬相关分子LC-3B与p62在SAP组中有显著上升，APD组p62水平较SAP组有显著下降（＜0.05，图4）。

使用全自动生化分析仪测定血清淀粉酶、脂肪酶，使用ELISA试剂盒测定炎症因子IL-1β、TNF-α。

2.2 APD对血清炎症因子的影响

取材后样本经3%戊二醛预固定，1%四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，Ep812包埋，半薄切片用甲苯胺蓝染色作光学定位，用钻石刀作超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅染色JEM-1400FLASH透射电镜观察。

采用Graphpad Prism 8.0和SPSS 22.0统计软件进行统计分析。所有数据以均数±标准差表示。组间比较采用单因素ANOVA 分析，两组间进一步比较采用LSD-检验分析。＜0.05为差异有统计学意义。

2.3 APD对胰腺组织内氧化应激水平的影响

SAP组较SO组胰腺内MDA水平上升，SOD、GSH水平下降（＜0.05）。在APD治疗后胰腺组织内MDA水平较SAP组显著降低，GSH水平较SAP组显著提高，差异有统计学意义（＜0.05），SOD水平较SAP组增高，但差异无统计学意义（＞0.05，图2B）。

2.4 APD对胰腺腺泡细胞亚细胞器结构及自噬的影响

罗爹爹说：”话是这样说，但就怕大家受不住，已经都听了一个星期了。我这两天腿子走不得，没有去打拳，我也听得心里慌慌神。你晓得，这个音乐蛮不吉利。”

胰腺组织HE染色结果显示，SO组胰腺组织结构基本正常，SAP组出现了明显的出血、水肿、腺泡细胞坏死，胰腺小叶结构破坏明显，病理学评分增高（＜0.05）；与SAP组相比，APD组胰腺组织损伤明显减轻，病理学评分降低（＜0.05，图1A、B)。SAP组血清淀粉酶、脂肪酶水平较SO组显著升高（＜0.05），APD组较SAP组降低（＜0.05，图1C、D）。

2.5 APD对胰腺组织Nrf-2/HO-1通路的影响

RT-PCR结果显示，APD组HO-1的mRNA表达显著高于SAP组（＜0.05，图5A）。Western blotting检测结果提示，SAP 组相较SO 组HO-1 表达水平显著提高，核Nrf-2水平显著降低（＜0.05）；同时与SAP组相比，APD 组HO-1 与核Nrf-2 水平显著上升（＜0.05，图5B）。

2.6 抑制HO-1后，APD对胰腺损伤及相关指标的影响

对APD 组使用HO-1 分子抑制剂ZnPP 后，Western blotting结果显示APD+ZnPP组胰腺组织HO-1分子表达较APD组明显降低（图6A）。与APD组相比，APD+ZnPP组胰腺组织病理损伤更加严重（＜0.05，图6E）；血清淀粉酶、脂肪酶水平显著提高（＜0.05，图6D）；血清炎症因子水平显著提高（＜0.05，图6C）；胰腺组织内MDA水平显著上升，SOD、GSH水平显著下降（＜0.05，图6B）。

3 讨论

前期的临床研究发现，在胰腺炎早期通过APD去除PAAF可以显著降低病人的全身炎症反应，延缓或避免多器官功能衰竭，且不会增加感染风险。有研究证实，APD可通过促进腺泡细胞凋亡，调控巨噬细胞极化等方式对SAP起到保护作用。自噬是胰腺炎发生与发展的核心环节，PAAF中含有的有毒物质可能通过JNK、PI3K/Akt等多种途径影响自噬，但目前其在APD中的作用尚未得到研究。本研究采用4%牛磺胆酸钠逆行注射法造SAP模型，在造模后12 h，所有大鼠均出现大量腹水。行APD治疗后，大鼠血清内促炎因子、淀粉酶、脂肪酶水平均显著降低，胰腺病理损伤程度减轻，提示APD治疗有效，与我们先前的研究结果一致。并且我们发现APD治疗后腺泡细胞自噬受损现象得到缓解。

重症急性胰腺炎中腺泡细胞的损伤与炎症、自噬、氧化应激等关系密切。既往研究表明，氧化应激产生的活性氧能够调控自噬活动。受损的自噬会造成毒性蛋白的聚集与线粒体损伤，进一步加剧氧化应激损伤。自噬受损导致自噬体在腺泡细胞中的积累造成腺泡细胞空泡化和胰蛋白酶积累是SAP的关键病理反应。本研究发现，诱发SAP后胰腺组织内氧化与抗氧化平衡失调，氧化水平提高，抗氧化水平降低，在APD干预后胰腺组织内氧化与抗氧化水平均向生理状态转移。在急性胰腺炎中，氧化应激被视为自噬损伤的中介因子。本研究通过透射电镜发现，SAP组大鼠腺泡细胞内自噬小体与酶原颗粒数量增多，并出现不同程度的线粒体损伤，提示诱发SAP后自噬增加。自噬相关蛋白是调节自噬过程的主要效应分子，其中LC-3B与p62是反应自噬不同阶段功能是否完整的标志。当自噬发生时，I型LC-3经过泛素化加工结合至自噬膜表面，形成LC-3B，其含量与自噬小泡的多少呈正相关。而p62则是连接泛素化底物与LC-3B的转运蛋白，当p62与底物结合进入溶酶体后即被降解，因此p62的含量常用来反应自噬活力。本研究发现SAP建模后胰腺组织内LC-3B与p62表达水平同步提升，符合自噬受损的表现，在使用APD干预后可见p62表达水平显著降低，提示自噬受损受到抑制，其作用可能与胰腺组织内氧化应激水平降低有关。

医院要完善新医改下的精细化管理工作，就需要有力的财经管理部门作为支撑，按照《医院财务制度》，实施全面预算管理，着力成本控制，有效防范风险，达成综合绩效目标，使财务工作实现闭环式管理。通过建立管理会计制度，促进医院财务精细化，科学化管理，优化流程，提升组织效率。但是，在这个阶段，医院财务人员的整体规模不足。这表明在推进管理会计的过程中，管理型人才实力就更加紧缺。

Nrf-2/HO-1信号轴是一条多脏器保护链，在自噬、抗氧化、调节炎症等多方面发挥重要作用，被视为自噬与氧化应激之间的耦合机制。目前已有多项研究表明，HO-1在多种疾病中起到重要的保护作用：HO-1不仅自身可促进多种细胞中的自噬并抑制凋亡，也分解血红素为胆绿素、Fe与CO。其中CO被证实可通过抑制NF-kb通路进而降低急性胰腺炎的严重程度，胆绿素具有较强的抗氧化能力，并且具有清除ROS的能力。本研究发现，SAP发生后早期产生的PAAF可抑制Nrf-2核转位。通过APD引流腹水后Nrf-2核转位显著增强，HO-1分子表达水平显著提升，组织内氧化应激水平受到抑制。在应用HO-1 特异性分子抑制剂ZnPP后，APD治疗效果减退，相比于APD组，胰腺损伤增加、炎症与氧化应激水平显著提高，提示Nrf-2/HO-1通路在APD治疗SAP的过程中发挥重要作用。

综上所述，APD可通过引流PAAF造成胰腺组织内Nrf-2/HO-1通路的显著上调，导致胰腺组织内氧化应激水平降低。本研究APD引流后，SAP大鼠腺泡细胞自噬受损情况明显改善，其可能与胰腺组织内氧化应激水平减少、Nrf-2/HO-1通路激活有关，为APD治疗重症急性胰腺炎提供了新的理论依据。