不同品种大麦内生菌的研究分析

任婷月，韩 英，甄 攀，李永强，王晓勇，闫福新

（山西杏花村汾酒厂股份有限公司技术中心，山西汾阳 032205）

植物内生菌是指能在健康植物组织内栖居，对植物不造成实质性危害且与植物建立了和谐联合关系的微生物。植物与其内生菌的这种共生现象在生物进化过程中历史悠久且普遍，内生菌具有促进植物生长、生物固氮、增加宿主植物抗病能力等作用。植物内生菌还是一种新的微生物资源，在寻找抗菌抗癌物质、抗植物病虫害方面，具有潜在的药用价值。此外，还有一部分植物内生菌为植物病原菌，会引起多种经济作物病害。植物内生菌分布广、种类多，目前研究的植物种类仅几百种。目前有关大麦内生菌的研究尚少。大麦是汾酒制曲原料之一，不同品种的大麦可能由于其内生菌多样性不同，对制曲造成一定的影响。

传统植物内生菌多样性的研究采用传统分离培养然后通过形态学、生理生化特性、分子鉴定方法进行鉴定。传统分离方法分离培养工作量大、鉴定过程繁琐复杂。近年来随着细胞学、遗传学、分子生物学等学科的发展，微生物的鉴定分类和多样性研究有了很大的发展，出现了很多新技术，如限制性片段长度多态性分析、变性梯度凝胶电泳、高通量测序等。Janpen 等通过变形梯度凝胶电泳（DGGE）和传统的培养方法相结合分析了栽培稻中内生细菌的群落结构多样性。Sessitsch 等用TRFLP 和DGGE 技术对不同马铃薯品种内生细菌多样性进行了研究。高通量测序技术可以对一个物种基因组进行细致全貌的分析，快捷方便的读取样品中复杂的微生物结构，具有明显的先进性和优势。目前，高通量测序技术已经运用于各种分子生物学领域，包括人体微生物研究、土壤微生物群落研究等。有关大麦内生菌多样性的研究尚少。本研究采用高通量测序技术对3 个不同品种的大麦内生菌进行了细菌16S rRNA V3—V4 区基因序列和真菌ITS2 区基因序列测序，对其内生菌多样性进行了对比研究，旨在为清香型白酒制曲原料大麦的选择与丰富提供合理依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：3 个不同品种的大麦分别标记为DM1、DM2、DM3。

试剂及耗材：MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit(100)，QIAGEN；2×Taq Plus Master Mix，Vazyme；Agencourt® AMPure® XP(核酸纯化试剂盒)，Beckman Coulter；KAPA Library Quantification Kit(文库定量试剂盒)，KAPA；MiSeq® Reagent Kit v3(600 cycle)(PE300)，illumina。

仪器设备：Eppendorf 高速台式冷冻离心机，Eppendorf；电泳仪，Bio-Rad ；ABI 9700 PCR 仪，ABI；凝胶电泳成像分析系统，UVP Bioimaging System；Agilent 2100 生物分析仪，Agilent；Labchip GX生物大分子分析仪，PerkinElmer；ABI Qpcr仪，美国ABI；高通量二代测序仪，illumina。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取

将10 g 大麦样品置于50 mL 无菌离心管中，加入1×PBS缓冲液后旋涡振荡，使得微生物从物体表面充分脱落并聚集在PBS 缓冲液中。将大麦样品用无菌镊子取出，转移至50 mL 无菌离心管中，直接研磨进行DNA 提取。使用PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories,Carlsbad,CA)试剂盒提取基因组DNA。使用NanoDrop 2000 型超微量分光光度计测定其浓度和纯度。

1.2.2 PCR扩增

利用细菌核糖体16S rRNA 基因的V3—V4 高变区进行扩增，建立克隆文库测序，相关引物对为338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') 和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。真核微生物扩增的序列为非编码rRNA 的ITS2 regions 区域，相关引物对为：上游引物为GATGAAGAACGYAGYRAA，下游引物是TCCTCCGCTTATTGATATGC。对不同样品的通用引物进行特异性设计，加入含有特异的8 个碱基的序列标签(barcode)进行区分。PCR 反应体系（总体系为25 μL）：12.5 μL 2xTaq Plus Master Mix、3 μL BSA（2 ng/μL）、1 μL Forward Primer(5 μM)、1 μL Reverse Primer(5 μM)、2 μL DNA（加入的DNA总量为30 ng），最后加入5.5 μL dd HO补足至25 μL。反应参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，28 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物使用1 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带大小，并用Agencourt AMPure XP 核酸纯化试剂盒纯化。

1.2.3 MiSeq 测序

PCR 产物用于构建微生物多样性测序文库，在北京奥维森基因科技有限公司使用Illumina Miseq PE300 高通量测序平台进行Paired-end 测序。测序原始序列上传至NCBI的SRA数据库。

1.2.4 数据分析处理

下机数据经过QIIME1（v1.8.0）软件根据Barcode 序列拆分样本，使用Pear（v0.9.6）软件对数据进行过滤、拼接。去除打分低值于20，含有模糊碱基，引物错配的序列。拼接后使用Vsearch（v2.7.1）软件去除长度小于230 bp 的序列，并根据Gold Database 数据库用uchime 方法比对去除嵌合体序列。使用Vsearch（v2.7.1）软件uparse 算法对优质序列进行OTU 聚类（Operational Taxonomic Units），序列相似性阈值为97%。每个OTU 都有一个代表序列，将代表性序列与一会物种的使用RDP 数据库进行比对，设置70%的置信度阈值，对每个代表性序列进行物种注释。再利用QIIME1（v1.8.0）软件进行α多样指数分析（包括Shannon、Simpson 和Chao1 等指数）。基于物种注释及相对丰度结果，使用R（v3.6.0）软件进行物种组成柱状图分析。使用QIIME1（v1.8.0）计算beta 多样性距离矩阵，并使用R（v3.6.0）软件进行PCA分析。

2 结果与分析

2.1 Venn图

OTU与物种呈现对应关系，可通过分析OTU分布情况了解样本中微生物的多样性与存在量。由图1 可知，9 个大麦样本共产生了158 个细菌OTU，3 个品种大麦共有细菌OTU 数为22 个，说明3 个品种大麦的细菌组成相似性不高。DM1 独有的细菌OTU 数50 个，DM2 独有的细菌OTU 数27 个，DM3独有的细菌OTU 数1 个。由图2 可知，9 个大麦样本共产生了239 个真菌OTU，3 个品种大麦共有真菌OTU 数为50 个，说明3 个品种大麦的真菌组成相似性不高。DM1 独有的真菌OTU 数58 个，DM2独有的真菌OTU 数43 个，DM3 独有的真菌OTU 数18个。

图1 基于细菌OTU的Venn图

图2 基于真菌OTU的Venn图

2.2 稀释性曲线

稀释性曲线是可以用来比较测序数据量不同的样品中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。3 个不同品种大麦样品的稀释性曲线见图3和图4。由图3 和图4 可知，曲线最终趋势都趋于平坦，说明此次测序深度能反映样品中的物种信息。

图3 细菌稀释性曲线

图4 真菌稀释性曲线

2.3 Alpha多样性分析

通过Alpha 多样性分析可以知道微生物群落的丰富度和多样性。Chao1 指菌种丰富度指数，用以估计群落中的OTU 数目，通常Chao1 指数越高，样品中物种丰富度越大。Shannon（香农指数）是用来估算样品中微生物多样性指数之一，通常Shannon 指数值越大，表示样本中物种多样性越高，反之，样品中的物种多样性越低。由图5 可知，DM1 的Chao1 指数与Shannon 指数均最高，说明DM1 的细菌丰富度和多样性最高，DM3 的细菌丰富度最低，DM2 的细菌多样性最低。由图6 可知，DM1 的Chao1 指数与Shannon 指数均最高，说明DM1 的真菌丰富度和多样性最高，DM2 的真菌丰富度和多样性最低。

图5 细菌Alpha多样性box图

图6 真菌Alpha多样性box图

2.4 细菌群落多样性

基于门和属水平，3 个不同品种大麦样品内生菌细菌群落结构见图7。

由图7（a）可知，基于门水平，大麦内生菌样本中，相对丰度较高的依次是蓝细菌门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）。DM1 中还有少量的厚壁菌门（Firmicutes），相对丰度为1.18%。

由图7（b）可知，基于属水平，大麦内生菌样本中，相对丰度较高的依次是蓝细菌门一类未分类的属（unidentified）、__、泛菌属（）、假单胞菌属（）。在DM1 中相对丰度依次为69.6 %、23.4 %、2.3 %、1.3 %，在DM2 中的相对丰度依次为68.9 %、29.3%、0.3%、0.2%，在DM3 中的相对丰度依次为64.4%、33.4%、1.7%、0.2%。DM1 中泛菌属（）和假单胞菌属（）的相对丰度较高，分别是2.3%和1.3%，DM3 中泛菌属（）相对丰度较高，为1.7 %。泛菌属()是一类革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科，细胞呈直杆状，大多数菌株能产生黄色素。泛菌属在自然界中分布广泛，主要存在于水和土壤中，寄主包括植物、人以及昆虫。研究发现，泛菌属还存在于多植物种子中，且多为优势类群。泛菌属作为多种植物内生菌具有固氮和促生功能，有些对植物病原菌具有生防作用。假单胞菌属（）是一大类革兰氏阴性菌，广泛存在于土壤、水、空气中，也是一种常见的植物内生菌。Rahman 等对来自于不同的品种、地理位置和世代的大麦内生微生物组进行研究，均检测到、和相关类群，并表明在温室条件下具有促进植物生长和抵抗真菌性病害等功能。在连续3 代的萝卜种子中，发现和也是主要类群。

图7 基于门(a)和属(b)水平细菌群落结构分布

2.5 真菌群落多样性

基于门和属水平，3 个不同品种大麦样品内生菌真菌群落结构见图8。

图8 基于门(a)和属(b)水平真菌群落结构分布

由图8（a）可知，在真菌门水平上，大麦内生菌样本中主要是担子菌门（Basidiomycota）和子囊菌门（Ascomycota）。3 个品种大麦样本中比例不同，担子菌门（Basidiomycota）和子囊菌门（Ascomycota）在DM1 中相对丰度依次为74.6 %、25.3 %，在DM2 中的相对丰度依次为82.6%、16.5%，在DM3中的相对丰度依次为53.6 %、46.3 %。子囊菌门（Ascomycota）在DM3中相对丰度较高。

由图8（b）可知，在真菌属水平上，大麦内生菌样本中，相对丰度较高的依次是一类未鉴定的属（unidentified）、链格孢属（）、类型孢子菌属（），在DM1 中相对丰度依次为70.1%、19.7 %、2.6 %，在DM2 中的相对丰度依次为83.2 %、16.3 %、0.2 %，在DM3 中的相对丰度依次为48.2 %、43.7 %、2.7 %。3 个品种大麦样本中比例不同，DM3 中链格孢属（）相对丰度较高。链格孢属()属于子囊菌，座囊菌纲，隔孢菌目，隔孢菌科，是一种在自然界广泛分布的暗色真菌，多数兼性寄生于植物上，少数腐生于土壤或多种有机质中。链格孢属是经济上重要的真菌属之一，大多数种类会引起多种经济植物病害，造成田间和产后损失。另外，DM1 中发现少量镰刀菌属（），相对丰度为2.6 %镰刀菌属是一类重要的植物病原真菌，对粮食生产有重大的危害。DM3 中发现少量短梗霉属（），相对丰度为2.1 %，掷孢酵母属（），相对丰度为1.5%。短梗霉属（）是一种世界性的酵母样真菌，因其能产生黑色素而被称为黑酵母。短梗霉作为生防菌可有效拮抗植物病原真菌和细菌。

2.6 PCA分析

PCA 分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，是一种对数据进行简化分析的技术。PCA运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴取能够最大反映方差值的两个特征值。样本组成越相似，反映在PCA 图中的距离越近。

图9 中横坐标PC1 和纵坐标PC2 分别表示排名第一和第二的主成分的得分，分别是55.79 %和20.47%，每个散点代表一个样本，散点的颜色和形状表示不同的分组，样本全部处于95 %置信区间内。从PCA 得分图的结果可以看出，3 个大麦品种组距离较远，细菌群落组成差异较大。图10 中横坐标PC1 和纵坐标PC2 分别表示排名第一和第二的主成分的得分，分别是54.13 %和29.22 %，样本全部处于95%置信区间内。从PCA 得分图的结果可以看出，3 个大麦品种组分布在不同的象限内，距离较远，因此真菌群落结构差异较大。由此表明3 个大麦品种内生菌群落结构差异较大。这与Venn图分析结果相吻合。

图9 基于细菌OTU水平的PCA分析

图10 基于真菌OTU水平的PCA分析

3 结论

不同品种大麦，其内生菌可能对大曲的发酵有不同的影响，本研究采用Illumina Miseq 高通量测序技术对不同大麦品种内生细菌和内生真菌群落结构进行了分析。

从细菌群落结构分析来看，在属水平上，3个大麦品种优势菌相同，相对丰度较高的依次是蓝细菌门一类未分类的属、__属，在DM1 中相对丰度依次为69.6 %、23.4 %，在DM2 中的相对丰度依次为68.9%、29.3%，在DM3中的相对丰度依次为64.4%、33.4%。丰度较低的泛菌属（）和假单胞菌属（）在3个大麦品种差异较大。由Venn 图分析和PCA 分析可知，3个大麦品种细菌群落组成差异较大。

从真菌群落结构分析来看，在真菌属水平上，3个大麦品种优势菌相同，相对丰度较高的依次是一类未鉴定的属（unidentified）、链格孢属（）、类型孢子菌属（）。在DM1 中相对丰度依次为70.1 %、19.7 %、2.6 %，在DM2 中的相对丰度依次为83.2 %、16.3 %、0.2 %，在DM3 中的相对丰度依次为48.2 %、43.7 %、2.7 %。3 个品种大麦样本中比例不同，DM3 中链格孢属（）相对丰度较高；DM1 中发现少量镰刀菌属（），相对丰度为2.6%；DM3 中发现少量短梗霉属（）和掷孢酵母属（），相对丰度分别是2.1%和1.5%。由Venn 图分析和PCA 分析可知，3 个大麦品种内生菌真菌群落组成差异较大。

Alpha 多样性分析结果表明，DM2 的细菌多样性和真菌多样性均最低。真菌属水平上，DM1 中发现少量镰刀菌属（），镰刀菌属是一类重要的植物病原真菌，对粮食生产有重大的危害。DM3 中能引起经济作物病害的链格孢属（）相对丰度较高为43.7 %，比DM1、DM2 分别高24%、27.4%。在清香型白酒制曲原料大麦的选择上，应避免选择含有镰刀菌属（）及链格孢属（）等植物病原菌，或植物病原菌含量较多的原料。