一株鹅源鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定

李春来 王利丽 刘勃兴 史秋梅

摘要 为对河北省张家口赤城县某肉鹅养殖场的雏鹅死亡病原进行检测，剖检雏鹅进行初步诊断后采用常规方法分离细菌病原，并对分 离菌进行鉴定试验以及药物敏感性试验。结果表明，分离菌经鉴定为鸭疫里默氏杆菌，对雏鹅具有较强致病性，分离菌对庆大霉素、卡那霉素和大观霉素等 8 种抗生素表现耐药，仅对阿莫西林表现敏感。

关键词 鹅;鸭疫里默氏杆菌;分离鉴定

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌 （riemerella anatipestifer，RA）引起的接触性传染病，是制约世界各国鸭、鹅、火 鸡等家禽的健康养殖的重要疾病[1，2]。家禽感染鸭疫里默氏杆菌后，临床表现为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎等纤维素性炎症。雏 鹅感染疫里默氏杆菌发病率极高，病死率在 10%～40%，最高可达 90%[3]。近年来，在我国有关鹅源鸭疫里默氏杆菌分离鉴定的报道 日益增多，并对我国鹅的健康养殖造成影响。

2019 年 6 月，河北省赤城县某家鹅养殖场雏鹅大量死亡，1 周 内发病率为 20%（1，000/5，000），病死率高达 90%（900/1，000），笔 者对该肉鹅养殖雏鹅死亡病因进行检测以及药物敏感性试验，以 期为该地区鹅鸭疫里默氏杆菌病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

河北省赤城县某鹅养殖场送检发病雏鹅。

1.2 试验动物

15 日龄雏鹅，购自赤城县某养鹅场，试验前试验室饲养 1 周。

1.3 方法

1）雏鹅发病及剖检 询问并记录养殖户雏鹅发病情况，剖检送检的病死雏鹅。

2）细菌的分离纯化 无菌采集病死雏鹅肝脏，用高压灭菌后的 棉拭子采集肝脏内部细菌，涂布于鲜血琼脂平板，参考文献中的方法将平板放置于烛缸中进行培养[4]。挑取优势菌株在小牛血清体积 分数为 0.05 的 TSB 培养基进行纯化培养，并对分离菌进行革兰氏 染色，镜检。

3）分离菌的生化鉴定 参照生化反应管说明书对分离菌进行生化鉴定，并参照说明书统计试验结果。

4）分离菌的 16S rDNA 序列分析 提取分离菌 DNA 作为模板， 16S rDNA 通 用 引 物 （序 列 为 16S-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，16S-R：GGTTACCTTGTTACGACTT）进 行 PCR，随 后进行产物测序，用 Lasergene 软件上的 Megalign 功能建立進化 树和同源性分析。

5）分离菌的致病性试验 参考文献中的方法制备菌液浓度为 1× 108cfu/mL 的分离菌菌液[5]。试验分为试验组和对照组，每组 5 只雏鹅。试验组雏鹅肌肉注射 0.5mL 调整浓度后的菌液。对照组每 只雏鹅注射 0.5mL 无菌的 PBS，观察雏鹅状态，并将病死雏鹅进行 剖检，分离病死雏鹅内脏细菌并鉴定。

6）分离菌的药物敏感性试验 按照美国临床和试验室标准协会 （CLSI）的 K-B 纸片扩散法操作标准进行分离菌的药物敏感性试验。

2 结果

2.1 雏鹅临床症状及病理变化

该养殖场共饲养雏鹅 5，000 只，发病雏鹅 1，000 只，发病率为 20%，病死率 90%。发病雏鹅精神倦怠，不食，排黄绿色稀粪，运动 失调。对病死雏鹅进行剖检，发现其心包膜以及肝脏表面有明显纤 维素性渗出物。

2.2 菌落与细菌形态

在鲜血琼脂平板上，菌落呈露珠状，表面光滑，湿润。半透明， 直径约为 1mm。分离菌为革兰氏染色阴性小杆菌，大部分单个散落存在。

2.3 分离菌的生化鉴定

试验结果显示，分离菌不发酵葡萄糖、果糖、蔗糖，VP 试验、硫化 氢产生、尿素分解、硝酸盐还原、甲基红试验、枸橼酸盐利用和靛基质试验均为阴性。将试验结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）中鸭 疫里默氏杆菌的生化特性比较，符合鸭疫里默氏杆菌的生化特性。

2.4 分离菌 16S rDNA 序列分析

结果显示，分离菌与 NCBI 中的鸭疫里默氏杆菌参考菌处于同 一分支，与大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌与巴氏杆菌的不处 于同一分支。同源性分析结果显示分离菌与 NCBI 中的鸭疫里默氏杆菌参考菌同源性在 99%以上。上述结果表明分离菌为鸭疫里默氏杆菌。

2.5 致病性试验

分离菌感染雏鹅后，雏鹅出现精神萎靡，站立障碍、不食、腹泻等症状，96h 后全部死亡。观察对照组雏鹅连续 2 周，未出现病征 以及死亡。剖检病死雏鹅，其心包膜与肝脏表面有明显纤维素性渗 出。从人工感染后病死雏鹅肝脏、心脏等脏器同样分离出鸭疫里默氏杆菌，对照组未分离出该菌。表明分离到的鸭疫里默氏杆菌对雏 鹅具有一定的致病性。

2.6 药物敏感性试验

试验结果显示，分离菌仅对阿莫西林表现敏感，对青霉素、氨 苄西林和新霉素等 7 种抗生素表现中敏，对庆大霉素、卡那霉素和大观霉素等 8 种抗生素表现耐药。表明分离菌具有多重耐药性。

3 讨论

鸭疫里默氏杆菌病是在雏鹅养殖过程中的常见疾病之一，并 且在雏鹅养殖过程中有较高的发病率及死亡率[6]。近年来，从雏鹅 上分离到鸭疫里默氏杆菌的报道日益增多，江苏、四川、山东、上海 等省市均有鹅感染鸭疫里默氏杆菌的报道[3，5，7-10]，并且分离菌株具 有较高的致病性。本次研究从河北省赤城县的某肉鹅场病死鹅体 内分离到 1 株鸭疫里默氏杆菌，并采用肌肉注射的方式感染雏鹅， 该方法是目前临床研究中较常见的鸭疫里默氏杆菌的感染方式， 结果显示分离菌株可致雏鹅死亡，表明分离菌株具有一定的致病性，因此，在鹅养殖过程中，鸭疫里默氏杆菌病的防治应得到重视。目前细菌病主要通过抗生素类药物进行治疗[11]。试验的 6 类 16 种 药物中（其中诺氟沙星、氧氟沙星为农业部公告的禁用兽药，仅用 于研究），分离菌仅对阿莫西林表现敏感，对庆大霉素、卡那霉素等 8 种药物表现为耐药，具有多重耐药性，并且对同一类的不同药物 敏感性差异较大，这可能与该场在送检前应用抗生素类药物治疗有关。将药物敏感性试验结果反馈该养殖场，该场应用阿莫西林治疗病鹅，2d 后，雏鹅发病情况得到控制。姜安安等[7]、杨永胜等[8]、赵 宝华等[10]的研究表明，从安徽、四川、扬州分离 RA 菌株对 β - 内酰 胺类药物敏感性最高，而且本次研究与赵宝华等[10]的药物敏感性 试验中发现阿莫西林的抑菌效果最佳，但该现象是否普遍存在需 进一步研究。本次分离到的 RA 与其他报道菌株相比，耐药性更强， 这可能与地方用药以及治疗情况不同有关。

本次研究从河北省赤城县某发病鹅场的雏鹅分离到 1 株鸭疫里默氏杆菌，并对分离菌进行致病性试验和药物敏感性试验，发现 分离菌对雏鹅具有一定的致病性和多重耐药性。

参考文献：

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[5] 刘小龙，卢荣辉，程龙飞，等.鹅源血清 11 型鸭疫里默氏杆菌分离株生物学特性分析[J].中国家禽，2017，39（1）：47-49.

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[7] 姜安安，王小兰，王少辉，等.血清 15 型鹅源鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及交叉免疫保护研究[J].中国动物传染病学报，2015，23（3）：17-23.

[8] 杨永胜，陈研，薛亚飞，等.4 株鹅源鸭疫里默氏杆菌部分生物学特性分析[J].中国动物传染病学报，2020，28（5）：62-66.

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[10] 赵宝华，徐步，范建华.鹅源鸭疫里默氏杆菌的分离和鉴定[J].中国畜牧兽医，2010，37（8）：189-192.

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