3D生物打印及其在组织工程中的应用

李红，吴佳成，郭闯

(1.暨南大学 化学与材料学院，广东 广州，511436 ；2.人工器官及材料教育部工程研究中心，广东 广州，510632)

3D打印又称增材制造技术，它基于分层制造的原理来实现材料的加工。在计算机软件辅助设计模型或计算机控制下,通过断层扫描，准确控制材料的成型[1],这种技术可快速制造复杂形状的组件。广义上讲，直接与生物医学领域相关的3D打印可视为3D生物打印，分为5个不同技术层次[2]，见图1。狭义上讲，3D生物打印一般是指与细胞混合后的3D打印[3]，或者打印后的材料用于细胞的生长以构建组织或者器官，即图1中的第三、四和五阶段。本文主要介绍的是第三阶段，即3D生物打印制造组织工程支架并应用于组织修复中的研究进展。

图1 生物三维打印发展的不同技术阶段Fig.1 Development stage of biological 3D bioprinting

组织损伤是常见病和多发病。为了修复受损的组织和器官以恢复它们的功能，20世纪90年代提出了组织工程这一理念[4]。组织工程是将种子细胞接种于三维组织工程支架，同时，添加一些生长因子或者药物，以修复受损组织的技术[5]。从设计上，它是先在体外构建器官或者组织，然后通过植入体内替换或者修复受损组织[6]。目前，组织工程是最有前景的人体组织修复或再生方法。

支架是组织工程三大要素之一，用以支撑细胞的生长和增殖。早期的组织工程支架在结构上一般是多孔的[7]，无法模拟人体组织复杂的三维结构，故细胞难以长入支架内部，导致修复失败或者不足。3D打印技术克服了早期组织工程支架加工的局限性，赋予了支架良好的孔隙率，增大了细胞与材料的接触面积，解决了细胞只能黏附于支架表面的问题，便于细胞黏附生长[8]。迄今为止，3D生物打印技术实现了高度复杂的生物结构的制造，从而改变了组织工程和再生医学领域的修复理念和方法[9]。

1 3D生物打印方法

迄今为止，已经出现了许多3D打印技术，例如熔融打印、挤出打印、喷墨打印、光固化打印和激光辅助打印等。下面简单介绍用于组织工程领域的3D生物打印技术。

1.1 熔融打印

熔融打印是一种将材料(通常是热塑性聚合物)在喷嘴处加热到半液态，然后喷射到基板上，在室温下暴露在空气中发生凝固，从而形成三维结构的打印方法[10]。它是通过喷嘴来控制X-Y轴方向和通过打印平台来控制Z轴方向的移动，精确制造想要的结构。打印过程高度依赖材料的热塑性，常用的材料有聚乳酸和聚碳酸酯等，也可以将多种材料复合进行打印。支架打印完成后，对支架的表面进行改性或者负载药物，然后接种细胞，经过一段时间的培养可用于组织修复[10]。

1.2 挤出打印

挤出打印是通过控制活塞、气动泵或螺钉的挤压使水凝胶通过喷嘴挤出到基板上的打印方法[11]。它的打印原理和熔融打印比较接近，但是挤出打印一般用于打印流体材料，例如生物墨水。挤出打印使用的生物墨水必须具有足够的黏度和交联能力，以便在打印的过程中和打印后保持良好结构。然而挤出打印的精度一般不高，为了克服这一缺点，研究人员开发了一些新技术，例如悬浮水凝胶的自由形式可逆嵌入(FRESH)技术[12]和低温挤出技术[13]。

1.3 喷墨打印

喷墨打印的机制和打印机的机理相同：通过热刺激、压电刺激或电磁刺激在喷嘴中产生气泡，由于气泡的形成和破裂产生的压力，打印材料以水滴的形式从喷嘴中喷射出来[14]。一般都是用热喷墨技术来打印含细胞的生物材料，因为压电刺激和电磁刺激对细胞有害，而热刺激一般的温度变化在4～10 ℃之间，且时间非常短，通常在2 μs左右。这种温度变化对细胞几乎无影响，甚至可能激活细胞促进血管的生成[15]。喷墨打印具有很高的分辨率，最高可以达到30 μm。喷墨打印对于材料的要求高，首先，喷墨墨水的黏度要求非常低，以确保它们能够正常沉积，同时，可以将细胞离开喷嘴时所受到的剪切力降到最低，通常来说，墨水的标准黏度应该小于100 mPa·s，剪切应力应保持在10 kPa以下以避免细胞活力显著下降[16]。但成型后墨水必须能够经过某种形式的二次交联且交联后具有一定的机械性能，以便打印结构可以在Z轴方向上不断地构建[16]。

1.4 光固化打印

光固化成型是最早的3D打印成型技术，也是目前较为成熟的3D打印技术。该技术的基本原理是利用材料的叠加成型，将一个立体的目标零件的形状分为若干个平面层，以一定波长的光束扫描液态光敏树脂，使每层液态光敏树脂被扫描到的部分固化成型，而未被光束照射的地方仍为液态，最终，各个层面累积成所需的三维支架[5]。光固化打印的打印速度极快而且能够打印复杂结构，但是它需要光线照射，并且材料的选择也受到限制，同时光固化打印的墨水还需要具有光敏性和剪切变稀的能力。光固化打印又可以分为立体光刻(stereo lithography，SLA)技术[5]和数字光处理(digital light processing，DLP)技术[17]，这两种技术的原理是相似的，都是通过紫外光或可见光照射光敏树脂固化成型。

1.5 激光辅助打印

激光辅助打印是将生物墨水以薄片或者薄膜的形式附在一层能量吸收材料(通常是金或者钛)上，然后从材料上方，发射激光在2层产生脉冲，引起相位变化，将细胞墨水喷射到下面的接收平台[18]。激光辅助打印最初用于金属制造，在组织修复中已被用于器官和组织的制造[1]。激光辅助生物打印具有较高的打印分辨率和细胞存活率，能够打印高密度的细胞生物墨水，但其设备昂贵，且对材料的要求较高，故没有被广泛使用[11]。

2 3D生物打印在组织工程中的应用

为了实现人体组织的体外构建，基于组织工程的原理，使用3D生物打印技术制造出各种组织工程支架或类组织、类器官[19]。

2.1 在硬组织修复中的应用

2.1.1 骨和软骨

骨骼是一种由纳米羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)和胶原蛋白组成的复杂组织，具有一定的自修复能力。骨组织工程支架的主要目标是促进骨骼修复，并且由于部分位置的骨在体内起到承重的功能，所以，使用的材料需要拥有一定的机械性支撑能力，例如生物活性陶瓷[20]和生物活性聚合物等[21]。但更重要的是，要能有效促进骨组织的修复和重建，所以支架常负载药物或者其他活性成分。TARAFDER等[22]通过3D打印制备了多孔磷酸三钙支架，其中使用了聚己内酯(polycaprolactone，PCL)负载阿仑膦酸盐涂附在支架的表面。阿仑膦酸盐是一种用于治疗骨质疏松症的药物。体外和体内的结果表明：该支架中负载的阿仑膦酸盐具有持续和受控释放能力，并且该支架可增加细胞活性并诱导骨形成。

CAETANO等[23]使用熔融螺杆挤出3D打印制造了PCL/石墨烯支架，其支架中的石墨烯纳米片均匀分布，支架上涂有乳胶蛋白。随后将人类的脂肪干细胞(human adipose derived mesenchymal stem cells，ADMSC)接种在支架上。结果表明:含有蛋白质和石墨烯的支架可促进脂肪干细胞的成骨分化，从而实现骨骼重建。

血管化一直是骨修复的难点。KUSS等[24]将ADMSC和人类的脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)包裹在透明质酸和明胶的生物活性水凝胶中进行共培养，然后将打印好的PCL/HAP支架浸泡在水凝胶中，最后，通过紫外照射进行光聚合，形成一个复合三维组织工程支架， 见图2。该复合支架能有效促进血管生成、细胞生长和迁移，在支架中形成了毛细血管样网络结构，有望用于较大骨缺损的修复。

图2 将打印的支架与充满细胞的水凝胶结合实验设计示意图。 图片转载已经许可(5222220310899)[24]Fig.2 The schematic diagram of experimental design，combine the printed scaffold with a cell-filled hydrogel Image reproduced with permission from(5222220310899)[24]

高精度支架和高细胞活力是目前3D生物打印的一大挑战，IDASZEK等[25]制作了一种由海藻酸盐+甲基丙烯酰化明胶+含硫酸软骨素的丙烯酸乙酯组成的水凝胶，再加入甲基丙烯酰化改性的透明质酸、磷酸三钙及干细胞和复合光引发剂，构成模拟钙化软骨的生物墨水。通过使用微流体打印结合挤出生物打印，甲基丙烯酰胺化的明胶和透明质酸的快速光固化，保证了打印精度。而硫酸软骨素、透明质酸和磷酸钙在成分上模拟了钙化软骨的组成。结果表明：该打印系统可以制造精度约为100 μm的仿生组织，并且细胞活力超过90%，在制造肌腱和软骨组织等方向具有应用前景。

虽然3D打印可以个性化地定制适合骨缺损部位的支架[19]，但目前的骨组织工程支架无法满足机械性能和生物相容性的要求。因此，对高强度墨水的制造是目前研究的热点，比如引入活性位点促进交联[26]、引入其他高模量的组分[27]等。

2.1.2 牙体及牙周组织

牙齿是人身体中最坚硬的组织之一[28]，牙体损伤与骨组织不同，损伤后难以自身修复。使用包含细胞、三维支架和生长因子的牙组织工程是目前较有前景的修复方法之一[29]。由于牙齿的组成和结构十分复杂，特别是在牙周组织部位，目前3D生物打印支架在牙科方面有一定的局限性。

LEE等[30]采用3D打印技术构建PCL/HAP支架，将人牙釉蛋白、结缔组织生长因子和骨形态发生蛋白包裹在聚乳酸-羟基乙酸聚合物中，并转移到已构建好的支架中形成一个三相支架。该研究通过设计不同孔径的孔洞来模仿牙本质、牙周韧带和牙槽骨等不同组织。在支架上接种牙髓祖细胞，皮下植入小鼠，形成了富含Ⅰ-胶原蛋白的组织，利于修复牙周组织。

PARK等[31]使用熔融3D打印技术成功制造了β-磷酸三钙/PCL牙体组织工程支架。该支架表面随着β-磷酸三钙含量增加变得更加粗糙多孔，能够有效促进小鼠间质干细胞的细胞生长和成骨分化，该支架有可能在体外构建“假牙”。

KHAYAT等[32]将人牙髓干细胞和含有内皮细胞的5%甲基丙烯酰化明胶注射到牙根段，该含有细胞的水凝胶促进了组织新血管形成。然而，目前关于牙组织工程的研究仅仅检查了血管神经样组织的形成，并没有证实新生组织的完整性和功能性，很多组织工程支架在体内植入后由于营养缺乏而坏死[33]。因此，通过3D生物打印建立完整的血液供应系统对于维持再生组织中的营养交换至关重要[33]。

2.2 在软组织修复中的应用

2.2.1 皮肤

皮肤作为人体最大的器官，其特点是不同层细胞种类和组织结构不同。LEE等[34]以角质形成细胞、成纤维细胞和胶原蛋白为材料，通过3D生物打印制造出多层结构。在这项研究中，利用了3D打印逐层打印的优势，使用不同的材料或者细胞打印不同的层面。当胶原蛋白层被打印出来时，一层成纤维细胞就被打印到上面，然后，再打印一层胶原蛋白层，重复上述的操作，最后，再打印角质细胞层。这种3D打印的皮肤模型在培养时期能够保持其整体的形状和结构，且保持了这2种细胞的细胞活性和增殖能力。

与挤出生物打印相比，光固化打印具有更高的打印速度和打印精度，并且由于没有挤压使细胞受力这一过程，所以，光固化打印的细胞存活率更高。PEREIRA等[35]开发了一种具有可控的机械特性和流变的单组分果胶基生物墨水，该生物墨水可以紫外光固化，再通过离子凝胶来调整其机械性能，或者也可以先通过离子凝胶来调节墨水的性能，提升打印精度，最后进行光固化成型。该生物墨水可用于层层之间力学性能不同的3D皮肤结构的生物打印，且作为细胞的载体，支持成纤维细胞的黏附和分化，在皮肤再生修复方向具有巨大的潜力。

然而，光固化中采用的紫外光可能会对细胞造成一些未知的不可逆的损伤。最近，WANG等[36]开发了一种具有良好生物相容性的基于Eosin Y(EY)的光引发技术，完美地解决了这一问题，其使用波长在500～600 nm。该生物打印系统可以轻松制备结构复杂的载细胞水凝胶，水凝胶内的细胞可以进行增殖，形成三维细胞网络。这种基于可见光的生物墨水的交联时间大约为10 min，因而适合长时间的生物打印。

3D生物打印可以制造结构复杂并且由多种细胞组成的皮肤组织，并且植入皮肤表面之后可以重建原生组织的结构与功能[37]，有助于皮肤伤口的修复。因此，3D打印皮肤被认为是最快应用于临床的产品。

2.2.2 血管

目前各种3D生物打印技术中，主要有2种方法[38]用于打印人造血管：1)挤出打印；2)光固化打印。

ITOH等[39]使用3D生物打印机制造了由ADMSC组成且内径为1.5 mm的无支架管状组织，然后，将这些组织放在灌注系统中培养，最后，通过超声波评估了流量并进行了组织学分析。结果表明：该管状组织在植入老鼠腹主动脉后的第2天和第5天，管道依旧通畅，并且在植入后第5天发现有一层内皮细胞。

YU等[40]开发了一种新型的同轴喷嘴，外环通道挤出含细胞的海藻酸盐溶液，内环通道挤出氯化钙溶液。当2种溶液接触时，立即发生交联，产生中空的海藻酸管状结构。支架与患者自身的内皮细胞同时打印有助于产生功能性血管。管状结构具有可灌注性和渗透性，利于血流循环，促进代谢和新组织的形成。

但同轴打印仍然存在不足，例如管子直径主要取决于喷嘴的几何形状，因此制造支管时存在困难。LI等[41]首先打印了Y形结构，然后，将最外层进行凝胶化，在内部未凝胶化的部分熔融后，整个结构浸入CaCl2中进行完全凝胶化，最后，剪除Y形底部以实现分支管状结构。

目前人造血管的3D打印仍有许多的问题需要解决，例如细胞和材料要求，异型血管形成[42]和功能化[43]等。

2.2.3 心脏

心脏是人体中重要的器官之一，是循环系统的重要组成部分，但是其本身在受到损伤时的修复能力十分有限。使用3D打印技术构建心血管结构，可以创建多孔结构用于营养物质和氧气的运输[44]。

GAETANI等[45]利用3D打印技术加工了一个由透明质酸和明胶组成的心脏贴片。体外研究表明：细胞在支架上的增殖分化能力良好。将打印的贴片移植到心肌梗塞的小鼠模型中，4周后，其心脏和血管分化标记物随时间增加。总体而言，该贴片可以促进心肌梗死后的心脏重构。

为了减小人体内免疫排斥反应，通常会选用自体的细胞及脱细胞基质材料进行治疗。NOOR等[46]从患者身上提取了一个网膜组织，并从组织中分离了细胞，并将脱细胞组织制备成水凝胶。分离出的组织细胞被重新编程为多功能干细胞，然后分化成心肌细胞(endothelial cells，EC)和内皮细胞(cardoimyocytes，CM)，随后与水凝胶混合，制备成生物墨水，最后通过3D生物打印，制造了带血管的心脏贴片和人工心脏，制备工艺过程见图3。该研究提供了一条打印与人体具有高度免疫学匹配的人工心脏的新型路径。

图3 3D打印人工心脏制备示意图。 图片转载已经许可[46]Fig.3 Conceptual schematic diagram of artificial heart via 3D bioprinting. Image reproduced with permission from[46]

众所周知，使用软蛋白和多糖水凝胶进行复杂三维生物结构的增材制造是难以实现的，但这两种材料又是人体组织最主要的组成成分。随着3D打印技术的发展， HINTON等[12]开发了一种新型的打印方式，也就是FRESH技术，基于此方法，成功使用胶原、海藻酸钠等材料打印了冠状动脉和股骨等一系列复杂的组织模型。目前3D打印技术可以制造精细结构模型，提供更好的解剖结构，让医生进行术前培训[47]，但是无法实现其功能化。为此， LEE等[48]开发了一个新的支撑水凝胶(FRESH v2.0)，以制造人工心脏。通过pH驱动打印胶原蛋白凝胶，其分辨率可达20 μm。打印的人心肌细胞的心室显示同步收缩，定向动作电位传播以及在收缩峰值期间壁增厚达14%。同时，该支撑浴可以大幅度提高细胞活力，促进新血管的生成，并且以胶原蛋白为生物墨水打印支架足以保障其生物相容性。该方法现在已经有能力重建原生组织的结构、力学和部分生物学特性，为人工组织结构制造开辟了新方向。

3 前景与挑战

目前3D生物打印在组织工程中的应用还有很多不足之处。从材料方面来说，可用于打印的材料较少，生物相容性、可控的降解速率和机械性能无法同时满足要求。打印技术方面，目前已经有将细胞与材料混合后进行打印的方法，但对支架内营养物质交换等问题仍然缺乏好的解决方案。最后，人体中的组织成分多样以及结构复杂，3D打印技术尚无法实现精准的仿生构造；并且，体外环境难以完全模拟细胞外基质[2]。

3D生物打印将生物学、医学和工学紧密结合起来，为解决上述问题，未来的发展方向是：1)提高打印精度，满足纳米尺度的仿生，从而实现更有效的组织修复，即结构和功能的修复；2)开发高性能的3D打印材料，能够将生物相容性、可降解性和机械性能三者兼顾；3)探索更多有效的结构设计，适应细胞微环境的结构[6], 从而促进组织修复；4)模仿组织的复杂成分、结构和功能；5)打印大尺寸、功能化的组织和器官。