HPLC法测定不同煎煮时间疏调气机汤中芍药苷和淫羊藿苷的含量

龙小妹 张艳娇 黄宽 林艾和 李蓉 夏宗霄 范源

摘要：目的 测定不同煎煮时间疏调气机汤中芍药苷和淫羊藿苷的含量变化。方法 按方药的组成称取制备好的疏调气机汤散12.4 g置于烧杯中，加纯净水在电磁炉上煎煮至沸腾，保持微沸时间依次为5、15、25、35、45 min，共煎煮两次，过滤、浓缩、甲醇溶解、超声、定容，微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法测定芍药苷和淫羊藿苷的含量。结果 芍药苷和淫羊藿苷分别在2.744～16.464 μg（R2=0.9992），0.504～3.024 μg（R2=0.9993）的范围内呈良好的线性关系。疏调气机汤中芍药苷和淫羊藿苷均在煎煮15 min时含量最高。结论 疏调气机汤中芍药苷和淫羊藿苷在不同煎煮时间下含量不同，本研究可为该方的最佳煎煮时间、临床指导用药和质量控制等提供一定的参考。

关键词：疏调气机汤;芍药苷;淫羊藿苷

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2022）04-0060-05

Determination of Paeoniflorin and Icariin in Shutiaoqiji Decoctionwith Different Decoction Time by HPLC

LONG Xiao-mei1， ZHANG Yan-jiao1， HUANG Kuan1， LIN Ai-he1， LI Rong1， XIA Zong-xiao1， FAN Yuan1，2

（1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China;2. The Second Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650216， China）

【Abstract】Objective： To determine the content changes of paeoniflorin and icariin in Shutiaoqiji Decoction with different decoction time. Methods： 12.4g of the prepared Shutiaojijitang powder was weighed according to the composition of the prescription and put in a beaker and pure water was added into the beaker and cooked on the induction cooker until it boiled， keeping the micro-boiling time as 5， 15， 25， 35 and 45 min， decocting twice in total and then filtered， concentrated， dissolved in methanol， sonicated， constant volume， filtered through a microporous membrane. The contents of paeoniflorin and icariin were determined by HPLC. Results： Paeoniflorin and icariin showed a good linear relationship in the range of 2.744 to 16.464 μg （R2=0.9992） and 0.504-3.024 μg （R2=0.9993）， respectively. The contents of paeoniflorin and icariin in Shutiaoqiji Decoction were the highest when decocted for 15 min. Conclusion： The contents of paeoniflorin and icariin in Shutiaoqiji Decoction are different under different decoction time. This study can provide some reference for the optimal decoction time， clinical guidance medication and quality control of the prescription.

【Key words】Shutiaoqiji Decoction; Paeoniflorin; Icariin

疏調气机汤是国医大师张震张老先生在临床七十余年根据疏调气机的思想上总结出来的经验方，其以四逆散为基础方，该方临床治疗效果显著且应用广泛。由君药（柴胡）、臣药（仙灵脾、白术、郁金、香附）、佐药（川芎、丹参、白芍、枳壳、茯苓）、使药（甘草、薄荷）组成[1]，该方具有疏肝理气、补益脾肾、调畅气机、活血行血之功能，主治肝失疏泄、脾肾不足、气机失常、血行不畅等证。张芳等[2]的临床研究表明，疏调气机汤可以调节甲状腺机能和治疗肝郁脾虚型桥本氏甲状腺炎合并甲状腺功能减退，缓解病人的情绪、改善失眠等症状。有报道指出[3]疏调气机汤还可以治疗鼓胀（胃间质瘤）。

身为“浙八味”之一的中药白芍属于毛茛科植物，为补血药，其主要成分芍药苷为单帖类糖苷化合物，化学性质不稳定，易于水解和挥发，因此在提取过程中应在低温条件下进行[4]。现代药理学研究表明，芍药苷有抗骨质疏松、促血管生成、抗抑郁、抗炎、镇痛、防治糖尿病并发症、抗肿瘤等多种作用[5-7]。

仙灵脾即淫羊藿，属于小檗科植物，为补阳药，其主要成分淫羊藿苷为黄酮类化合物，化学性质稳定。现代药理学研究表明，淫羊藿苷具有抗骨质疏松[8]、抗炎、抗癌、抗衰老、促进生殖系统等多种作用[9]。

疏调气机汤的核心是白芍、仙灵脾、柴胡、茯苓和白术这五者之间的配伍[10]，其中作为臣药的仙灵脾和使药的白芍在该方中所用剂量较高，因此疏调气机汤临床疗效的突出与白芍和仙灵脾具有一定的关联。汤剂的临床疗效与煎煮时间密切相关，若煎煮时间不够，有效成分未能完全溶出;若煎煮时间过长，则有效成分易受热分解或挥发，从而影响汤剂的整体治疗效果。经查阅文献，未发现有疏调气机汤中化实验的文章，因此本实验通过测定不同煎煮时间疏调气机汤中芍药苷和淫羊藿苷的含量，为该方的最佳煎煮时间、临床指导用药和质量控制等提供一定的参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 本实验所用仪器见表1。

1.2 试药 柴胡、郁金、仙灵脾、丹参、川芎、枳壳、白芍、白术、茯苓、薄荷、甘草均购于云南中医药大学校医院药房;香附购于云南巧丝（声贝）科技有限公司（批号：20072418）;芍药苷对照品购于四川省维克奇生物科技有限公司（批号：wkq20041008，HPLC ≥ 98%）;淫羊藿苷对照品购于四川省维克奇生物科技有限公司（批号：wkq20042802，HPLC ≥ 98%）。

1.3 试剂 本实验所用试剂见表2。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈（C）-0.1%磷酸（D）梯度洗脱（梯度洗脱程序见表3）;流速：1.0 mL/min;检测波长：270 nm;柱温：30 ℃;进样量：10 μL。色谱图如图1所示。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷6.86 mg，置于5 mL的容量瓶中，加甲醇（分析纯）定容成1.372 mg/mL的溶液，备用。精密称取淫羊藿苷2.52 mg，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇（分析纯）定容，即得0.252 mg/mL的淫羊藿苷溶液，备用。

2.2.2 疏调气机汤散的制备 按照疏调气机汤的方药组成：柴胡10 g，丹参10 g，香附10 g，郁金10 g，白芍12 g，仙灵脾15 g，川芎10 g，茯苓15 g，枳壳10 g，白术10 g，甘草6 g，薄荷6 g，分别称取药材，随后经高速万能粉碎机打粉，即得疏调气机汤散，备用。

2.2.3 疏调气机汤水煎液的制备 取疏调气机汤散5份，每份12.4 g，分成5组，分别标记为5、15、25、35、45 min。上述5组药材分别置于烧杯中，加149 mL纯净水，料液比为1∶12，浸泡20 min[11]。浸泡完成后，将烧杯放置于垫有石棉网的电磁炉上（功率400W，温度80 ℃）加热，待药品沸腾后，继续保持相同功率和温度持续微沸状态，在此期间，并用玻璃棒时不时地搅拌，微沸时间依次为5、15、25、35、45 min。待煎煮时间完毕后，趁热过滤。共煎2次，合并提取液，即得五组不同煎煮时间的疏调气机汤水煎液。

2.2.4 疏调气机汤供试品溶液的制备 将疏调气机汤水煎液转移至旋转蒸发仪上减压回收溶液至干（温度为60 ℃[12]），加甲醇（分析纯）溶解残渣，转移至锥形瓶中，超声30 min（温度为49.33 ℃），过滤，滤液转移至50 mL容量瓶中，加甲醇（分析纯）定容，即得疏调气机汤供试品溶液。

2.3 线性关系考察 分别取“2.2.1”项下的芍药苷和淫羊藿苷对照品溶液，0.45 μm微孔薄膜过滤后，依次精密吸取 2、4、6、8、10、12 μL，按“3.1”项下色谱条件进样，记录峰面积。以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性拟合，得芍药苷的回归方程为Y=75.709X+197.31，R2=0.9992;淫羊藿苷的回归方程为Y=1983.2X+32.9，R2=0.9993。结果表明芍药苷在2.744～16.464 μg，淫羊藿苷在0.504～3.024 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 稳定性实验 取煎煮时间为15 min的疏调气机汤供试品溶液，室温放置0、2、4、6、8、10 h，0.45 μm微孔薄膜过滤，按“2.1”项下色谱条件进样进行测定，通过计算得出芍药苷峰面积的RSD值为 1.40 %（n=6）、淫羊藿苷峰面积的RSD值为1.58 %（n=6），结果表明疏调气机汤供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.5 精密度实验 取“2.2.1”项下的芍药苷和淫羊藿苷对照品溶液各0.3 mL混合，0.45 μm微孔薄膜过滤，按照“2.1”项下的色谱条件，连续进样6次，计算得芍药苷、淫羊藿苷峰面积的RSD值分别为1.26%（n=6）、0.92%（n=6），結果表明本实验所用仪器的精密度良好。

2.6 重复性实验 取“2.2.3”项下的方法制备一份15 min的疏调气机汤水煎液（记录总体积），用移液管精密移取5份，每份40 mL。按照“2.2.4”项下方法制备各疏调气机汤供试品溶液，0.45 μm微孔薄膜过滤，按照“2.1”项下色谱条件进样进行测定，记录色谱峰的峰面积，计算得出芍药苷、淫羊藿苷的峰面积RSD值分别为2.77%（n=5）、1.14%（n=5），结果表明疏调气机汤供试品溶液的重复性良好。

2.7 加样回收率实验 精密量取已知芍药苷含量为5.59 mg/g，淫羊藿苷含量为1.02 mg/g的疏调气机汤散各6份，每份加入相同含量的芍药苷和淫羊藿苷对照品溶液适量，按“2.2.3”项下方法制备疏调气机汤水煎液，再按“3.2.4”制备各供试品溶液，按“2.1” 项下色谱条件进样进行测定，结果见表4。

2.8 含量测定 按照“2.2.3”项下方法制得五个不同煎煮时间段的疏调气机汤水煎液，再按照“2.2.4”项下方法制得各疏调气机汤供试品溶液，用0.45 μm微孔薄膜过滤，在“2.1”项下色谱条件进样进行测定，计算疏调气机汤在不同煎煮时间条件下芍药苷和淫羊藿苷的含有量，结果见表5。

2.9 不同煎煮时间下含量变化 疏调气机汤中芍药苷和淫羊藿苷的含量受煎煮时间影响较大，其含量变化趋势为：芍药苷的含量在5～15 min内显著增加，15 min达最高峰，在15～45 min内显著下降，其中15～35 min与35～45 min内的变化比较，15～35 min下降稍缓和，35～45 min下降较迅速;淫羊藿苷的含量在5～15 min内对于芍药苷此时间段的增加稍缓和，15 min达最高峰，在15～45 min内显著下降，其中15～25 min内下降最快，且芍药苷的含量明显比淫羊藿苷高，结果见图2。

3 讨论

本实验测定了不同煎煮时间疏调气机汤中芍药苷和淫羊藿苷的含量，结果表明，在线性范围内，这两种成分的含量均在煎煮15 min时最高，且芍药苷的含量明显比淫羊藿苷高，在15 min后随着煎煮时间的延长，两者都呈现下降趋势，因此根据本实验所得结论，建议疏调气机汤在煎煮用药时，可煎煮15 min。本实验结果具有一定的可信性，为疏调气机汤的最佳煎煮时间、临床指导用药和质量控制等提供一定的参考。

导致此结果的原因可能是：在煎煮5 min时，由于煎煮时间太短，导致其成分溶出不完全;在煎煮15 min后，由于芍药苷为单萜类化合物，化学性质不稳定，所以在此时间点之后随着煎煮时间的延长，芍药苷可能挥发或者发生水解，导致含量减少。淫羊藿苷为黄酮类化合物，化学性质较稳定，只在强酸强碱的情况下结构式才容易发生改变[13]，通过陈彦等[14]的实验得出，随着煎煮时间的延长和温度的升高，淫羊藿苷的含量均随之增加，而本实验在提取样品和处理样品中都只考虑芍药苷的不稳定性而采取较低温度进行，可能导致淫羊藿苷溶出较少。在实验过程中，因为是采用电磁炉加热，样品中所加的水分会随着煎煮时间的延长而蒸发，从而导致煎煮液减少，故对实验结果有一定的影响。

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（收稿日期：2021-10-12）