包装保存方式对陈旧生物检材STR 检验的影响

杨电 帅军云 胡慧英

（1.广州市公安局，广东 广州 510030；（2.广州市公安局黄埔分局，广东 广州510000）

对于法医生物检材的包装保存方法，法医学教科书和公共安全行业标准《法医生物检材的提取、保存、送检规范》均提出斑迹类生物检材宜晾干后放置在透气纸质物证袋中阴凉干燥处保存或冷藏保存［1］。但在实际工作中，很多斑迹类生物检材都是放常温保存，难以做到冷藏保存。近年来由于积案攻坚，许多保存数年甚至数十年的案件生物检材被要求重新进行STR 检验。本文对近5 年来检验的保存时间10年以上的59 宗案件149 份包括血痕、唾液斑（包括口腔拭子、烟蒂）、精斑、接触细胞类等斑迹生物检材的STR检验情况进行了统计分析。

1 材料与方法

1.1 样本

广州市公安司法鉴定中心2015～2020 年检验的常温保存时间10 年以上的59 宗案件149 份斑迹生物检材（见表1），包括血痕、唾液斑（包括口腔拭子、烟蒂）、精斑、接触细胞类检材等。这些检材有19 份用纸质物证袋包装后放电子除湿干燥柜保存；94 份先用纸袋包装再放塑料袋密封保存或直接用塑料袋包装保存；36份只用纸质物证袋包装保存。149 份生物检材中61 份检材为案发当时检验过，现在要求复核和加做基因座，88份检材未检验过。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

（1）血痕、烟蒂、口腔拭子、脱落细胞检材等：取适量检材于离心管或带提蓝的离心套管中，加入FW-超微量磁珠法DNA 提取试剂盒（长春市博坤生物科技有限公司）的裂解液FW 300µL 56℃保温 2h 后 95℃ 10min，12000rpm 离心3min。将裂解产物转移到试剂条的A→B→C孔中，每孔100µL，同时向洗脱孔（H）中加入30～60µL 洗脱液。将加好液的试剂条板架和塑料磁套装载在KingFisher 核酸纯化仪（长春市博坤生物科技有限公司）中的指定位置，选择FW300_H程序运行。

（2）精液阴道液混合斑：剪取10mm×10mm左右可疑斑迹，加入500µL TNE 浸泡约30min，期间振荡数次，10000rpm 离心1min，取上清100µL 用人精液PSA 金标试剂条（北京芬格尔安科技有限公司）进行精斑确证试验。管中再加入 50µL 10% SDS，10µL 20mg/mL 蛋白酶 K（美国QIAGEN 公司），混匀后置37℃保温5h 以上，采用套管10000rpm离心5min去除载体，吸取上清200µL 转移至另外离心管中，加入500µL配制的裂解液（Lysis：1M DTT为100∶1，美国Promega 公司） 震荡混匀，按文献采用DNA IQ Casework Sample试剂盒（Promega公司，美国） 在Maxwell™ 16 自动仪 （Promega 公司，美国）平台上提取女性DNA，洗脱液60µL。吸弃剩余的上清，沉淀用500µL TNE 洗2 次，然后将沉淀加入500µL 配制的裂解液震荡混匀，95℃保温10min，吸出液体按文献［2］提取DNA，洗脱液30～60µL。

1.2.2 STR扩增及其分型

常染色体STR 检验用PowerPlex®21 System Kit（美国Promega 公司）试剂盒进行复合扩增，Y 染色体STR 检验采用 Yfiler®Plus（美国AB 公司）或AGCU Y37、AGCU YSUPP Plus 试剂盒（中德美联公司）扩增。扩增体系为10～15µL，模板用量为6～9µL，扩增循环数为30～32 个循环。在AB 3130xl或3500xl遗传分析仪上进行毛细管电泳根据行业标准GA/T1163-2014《人类DNA 荧光标记STR 分型结果的分析及应用》规定，两个检材不少于13 个STR 基因座的基因型相同时才能判断为匹配，因此检材以获得性别及13 个以上STR 基因座的明确分型为有效检出，并分析扩增效果。

2 结果

149 份常温保存的斑迹生物检材总体情况如表1 所示。其中78 份血痕检材，30 份用纱布、滤纸或棉签转移的血痕用透气纸质物证袋包装后放纸箱或开放的货架上保存，检验时发现颜色变暗或变成锈黄色，提取DNA 进行STR检验均未检出有效STR 分型（见图1）。38 份血痕，其中18 份用纱布、滤纸或棉签转移的血痕，20 份附着在钥匙、刀具、砖头、棍棒、衣物、纸张等载体上的血痕，用透气纸袋包装后用塑料袋保存或直接用塑料袋保存，检验时发现血痕颜色变暗红。除4 份用滤纸或棉签转移的血痕未检出有效STR 分型外，34 份血痕均成功检出有效STR 分型，特别是附着在载体上保存的血痕基本上都能检出全部基因型，但出现提示降解的坡形峰（见图2）。10 份用干燥柜保存的血痕颜色也变暗红，有6 份用纱布或棉签转移，4 份为附在载体上的血痕，提取的DNA均检出全部基因型，且坡形峰现象不明显（见图3）。3 种检材保存方式对血痕STR 检出效果的影响（见表2）。

表1 149份常温保存的斑迹生物检材总体情况

表2 3种检材保存方式对血痕STR检出效果的影响

图1 16年前用纸袋保存的血痕及STR分型结果

图2 20年前用塑料袋保存的内裤上血痕及STR分型结果

图3 干燥柜保存的20年前血痕及STR分型结果

22 份唾液斑检材，有6 份唾液纱布和口腔棉签只用纸袋保存，提取DNA 均未检出STR 分型。塑料袋保存的10 份唾液斑检材除1 枚烟蒂和2 个口腔棉签提取的DNA 未检出有效STR 分型外，其它5枚烟蒂和2个口腔棉签均成功检出有效STR 分型，但有不同程度的坡形峰甚至丢峰现象。干燥柜保存的6 枚烟蒂则成功检出全部基因型（见表3）。

表3 3种检材保存方式对唾液斑STR检出效果的影响

7 份精斑检材均为阴道液精液混合斑，包括5 份阴道拭子和1 份衣物上精斑、1 份卫生纸上精斑。4 份塑料袋保存的精斑均成功检出精子有效的STR 分型，但有不同程度的坡形峰甚至丢峰现象。3 份干燥柜纸袋保存的精斑均成功检出精子的全部基因型，且峰高均衡（见表4）。

表4 3种检材保存方式对精斑检材STR检出效果的影响

由于当时检验条件的限制，10 多年前很多案件没有检验接触DNA，这些接触细胞检材只作为普通物证原物用塑料袋包装后放在物证室。近几年为破积案，这些检材被翻出来要求检验。送检的42 份可疑接触细胞检材，包括怀疑为做案工具的砖头、刀具、绳索、指甲内容物等，有21 份检出有效STR 分型，但有不同程度的坡形峰甚至丢峰现象（见图4）。

图4 塑料袋保存的17年前铁锤及锤柄擦拭物STR分型结果

3 讨论

本文对59 宗积案149 份斑迹生物检材的STR 检验效果分析表明，生物检材的保存方法相比保存时间对STR 检验成败更为重要，这和路镜玉等人［3］的观点相似。南方地区大部分时间处于高温潮湿环境，干燥的生物检材保存在透气纸袋中在梅雨季节往往因反复吸潮而发霉腐败，导致DNA 降解无法检出STR 分型；而检材干燥后保存在塑料袋中因为隔绝了水分、空气，反而不容易霉变降解，因此可能成功检验STR；干燥柜保存的检材干燥效果最佳，STR检验效果基本不受影响。对10 年以上积案检材的检验发现，同一案件中，当事人的血样或口腔拭子、现场转移血痕、烟蒂等因长期保存在纸质物证袋中导致STR 检验失败，而附在做案工具或物品上的血痕、唾液斑、接触细胞、精斑等检材因用塑料袋包装保存却能成功检出STR基因型。特别是口腔拭子、烟蒂等唾液斑检材，保存在纸袋中经常不到5 年就难以检出有效STR 分型，但保存在塑料袋中十多年都可能成功检出。如2004 年1 例命案，嫌疑人在现场留下了3个烟蒂，当时提取检验后用塑料袋常温保存，2020 年复检时，1枚烟蒂检验多个国产试剂盒均能检出全部基因型，另2枚烟蒂检验时也只发生部分等位基因丢失现象。用塑料袋保存的94 份血痕、唾液斑、接触细胞等检材有27 份未检出有效STR 分型，这些检材保存的年限并不是最长的，如4 份转移血痕保存时间均不超过12 年就无法有效检出，有些转移血痕在同样的环境下保存时间超过16 年也能检出全部基因型，分析原因可能是检材未完全晾干就放入塑料袋保存，塑料袋没有很好封口或者检材细胞量太少。

因为实践中发现潮湿的天气对生物检材保存的破坏性，有些分局购买了电子式干燥柜来保存生物检材。电子式干燥柜是利用高效吸湿材料的吸湿性能来进行柜内湿气的抽湿，在柜内吸收湿气之后，对材料进行加热，从而将湿气气化，通过叶门直接排至柜外，以此维持柜内物品的干燥。实验表明，19 份纸袋包装保存在干燥柜10 多年的血痕、唾液斑、精斑等检材的STR 检验效果和新鲜检材类似，不仅能检出全部基因型，而且峰高均衡。因为干燥柜容量的原因，这些单位在干燥柜太满时会将放置比较久的检材取出用塑料自封袋封好或用塑料袋抽真空包装常温保存。该19 份干燥柜保存的检材中有5 份是2000～2004 年的检材，3年前取出后用塑料自封袋封好保存，今年检验多个国产试剂盒也能检出峰高较均衡的全部基因型。

可见，斑迹生物检材要实现长期安全保存，保持干燥环境最关键。生物检材置干燥柜内保存干燥条件最好，STR 检验效果也最佳，其次是检材干燥后塑料袋保存，透气纸袋保存不能保证检材受环境湿度变化的影响，高温潮湿环境长期保存的斑迹生物检材均无法检出有效STR 分型。另外，有研究表明，纸质物证袋包装生物检材，DNA 转移到物证袋上的量显著高于塑料袋包装，可能影响到微量生物检材的检验［4］。其实，生物检材的保存和食品的保存类似，水分和氧气是影响安全保存的最重要因素，为延长食品的保鲜，现代主要采用塑料袋加保鲜干燥剂密封或抽真空保存的方法。2012 年左右，本单位开始对数据库采集的人员口腔拭子、血卡在检验后抽真空干燥保存，对现场斑迹检材采用棉签转移后放置在带干燥剂的塑料套管悬空保存［5］，原物提取的检材干燥后放置在塑料自封袋内保存，检验后的检材干燥后用塑料自封袋装好再放置在塑料整理箱内保管，减少了水分和氧气对检材的不利影响，因此2012 年以后的检材复检基本上都能获得完整的STR 分型。综上所述，法医教科书和行业标准对法医生物检材保存方法的规定有必要与时俱进，借鉴这些有效做法进行修改，让生物检材实现长期安全保存。