一例禽白血病的病理学分析及qRT-PCR诊断

方 天， 单春兰， 成虹松， 李 梅， 宋 春， 程振涛

(贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025)

禽白血病是由禽白血病/肉瘤病毒群中的禽白血病病毒 (Avian leukosis virus，ALV)感染引起，该病可导致禽类多种不同类型的恶性肿瘤，造成免疫性病变，被我国列为二类动物疫病，是危害世界养禽业的主要动物疫病之一[1]。ALV属于逆转录病毒科，ɑ逆转录病毒属，主要感染鸡、火鸡、鹌鹑、鸽等禽类物种[2]。ALV进入机体后优先攻击造血系统，在家禽造血组织的细胞中迅速增殖。病禽临床表现为淋巴细胞性白血病、髓细胞样白血病、红细胞性白血病、骨硬化病以及各类型肿瘤等，其中淋巴细胞性白血病最为常见，对世界养禽业的影响和危害最大[3]。2021年4月，贵州省惠水县某鸡场出现发病死亡病例，发病率22%，病死率7%。病鸡主要表现精神萎靡、消瘦虚弱、食欲不振、被毛无光泽，个别有腹泻症状。为了确诊感染病原，特进行实验室病理学检查及病原学诊断，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 检测病料采集该鸡场送检的6只临床病(死)鸡肝脏作为检测病料。

1.2 主要试剂HE染液套装，购自武汉赛维尔生物科技有限公司；柱式RNA提取试剂盒、禽白血病病毒实时荧光定量PCR试剂盒，购自北京世纪元亨生物科技有限公司；石蜡、二甲苯、无水乙醇、中性树胶，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器台式高速冷冻离心机(型号：ScanSpeed 1730R)，购自丹麦LABOGENE公司；实时荧光定量PCR仪(型号：CFX Connect)，购自美国Bio-Rad公司；转轮切片机(型号：HS2026)，购自华速科技有限公司。

1.4 病理剖检对送检的病(死)鸡进行剖检，观察病理变化并记录病理特征。

1.5 组织显微病变观察取送检鸡的肝脏样品6份，于多聚甲醛固定液中固定，经脱水-透明-浸蜡-包埋。将蜡块放入石蜡切片机制作石蜡切片(厚度3～4 μm)。切片经摊片机40 ℃温水展平后使用载玻片取出，放入60 ℃烘箱内烤片后取出常温保存，经苏木素-伊红染色后使用中性树胶封片，观察病理组织学变化并拍照。

1.6 禽白血病病毒核酸检测分别取6份鸡肝脏样品，研磨，8 000 r/min离心2 min，取上清液，使用无RNAse(核糖核酸酶)的柱式RNA提取试剂盒提取RNA，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测，总反应体系20 μL，在PCR扩增仪上进行下列反应：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40次循环，每次循环的第2步(60 ℃ 35 s)收集荧光信号。

2 结果

2.1 病理变化剖检病(死)鸡可见肝脏肿大，有明显呈球形的粟粒状细胞瘤增生，均匀分布于肝实质中，呈灰白色；脾脏、肾脏、法氏囊均有不同程度的肿大，结构较为松散；心肌颜色较浅；肠管未见明显异常病变。

2.2 组织显微病理变化100倍显微镜检可观察到鸡肝小叶结构被增生的肿瘤细胞挤压变形，肝索变窄，大量肿瘤细胞挤压组织细胞而不是浸润其中(见图1)。250倍显微镜检可发现广泛的炎性细胞和肝细胞空泡变性，未见脂肪变性，有大量出血点，且细胞破损坏死(见图2)。400倍显微镜检可观察到病变区域产生坏死性、局灶性的胞浆，胞浆内可见大量圆球形嗜酸性物质颗粒的髓细胞样瘤细胞，并可观察到不同发展时期的分裂相。病灶内大部分肝细胞变性坏死，肿瘤细胞增生，细胞核呈空泡状(见图3)。

图1 肝小叶结构(100×)

图2 肝细胞空泡变性(250×)

图3 典型肿瘤细胞病理性核分裂(400×)

2.3 禽白血病病毒核酸检测检测结果见图4：阳性对照出现特定的扩增曲线，Ct值≤30；阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，实验成立。6份送检肝脏样品Ct值分别为18.71、22.30、22.08、14.80、21.62、22.30，提示样品中均存在禽白血病病毒。

+：阳性对照；-：阴性对照；1～6：送检样品图4 ALV qRT-PCR检测

3 结论

通过实验室病理学观察及qRT-PCR检测，诊断为禽白血病病毒感染。

4 讨论

禽白血病是影响世界养禽业的重大动物疫病之一。ALV主要通过垂直传播，且病毒亚型较多，各型之间基本无交叉免疫力。禽类被ALV感染后无法产生特异性免疫，而是发展成持续的病毒血症，且可与其他肿瘤性疾病混合感染，造成机体免疫抑制[4]。被感染的群体生产性能急剧下降，严重影响养殖效益。同时有研究表明，同代鸡群中往往存在ALV-A、B、J 3种不同亚型的混合感染[5]。混合感染增加了病毒重组的概率，还加大了检测和防控难度。目前尚无有效的商品化疫苗预防禽白血病，也没有特效药物治疗[6]。控制禽白血病最有效的措施是淘汰有禽白血病病史的种群，培育无白血病的种群。实践表明，做好种群净化工作是防控禽白血病最有效的方法，并对有感染风险的养殖场采取严格的预防性消毒措施，降低禽白血病传播的风险；无感染风险的养殖场要保证引进的种禽来自无白血病的种群，避免引入病原造成感染。